基于磁珠的ABO-Rh(D)血型檢測(cè)蛋白質(zhì)芯片的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、ABO和Rh血型鑒定是日常獻(xiàn)、輸血的必檢項(xiàng)目,臨床常用血型檢測(cè)方法主要有平板法、試管法、微孔板法、微柱凝膠法和全自動(dòng)血液分析儀等,這些方法都是基于紅細(xì)胞的凝集反應(yīng),會(huì)受溶血等因素的影響,且檢測(cè)通量較低。也有研究利用基因芯片進(jìn)行血型判定,一定程度上可以規(guī)避血清學(xué)方法的弊端,但是操作繁瑣、耗時(shí),并且需要依賴(lài)于昂貴的儀器。本研究將免疫磁珠與蛋白質(zhì)芯片技術(shù)相結(jié)合,根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理進(jìn)行血型判定,并引入補(bǔ)體C1q作為共同示蹤物,實(shí)現(xiàn)抗原、抗體的

2、同步檢測(cè),為進(jìn)一步構(gòu)建高通量、自動(dòng)化、方便快捷的血型鑒定方法打好基礎(chǔ)。
　　目的:
　　構(gòu)建一種以磁珠為標(biāo)記物的,用于ABO正反定型和Rh(D)血型鑒定的蛋白質(zhì)微陣列方法。
　　方法:
　　1.將蛋白質(zhì)偶聯(lián)磁珠點(diǎn)樣于醛基、高分子三維基片D和氧化型瓊脂糖基片表面,過(guò)夜固定后洗去未連接的探針,取各基片樣點(diǎn)信號(hào)值進(jìn)行分析,比較蛋白質(zhì)在三種基片表面的固定效率。將抗體固定于三種基片表面,再加入相應(yīng)二抗偶聯(lián)磁珠與之反應(yīng),檢測(cè)

3、反應(yīng)后的信號(hào)值,比較三種基片表面固定蛋白質(zhì)的反應(yīng)活性。根據(jù)比較的結(jié)果選擇出適合本實(shí)驗(yàn)的基片。分別在不同的瓊脂糖濃度、點(diǎn)樣濃度、固定時(shí)間、固定溫度、洗滌方式等條件下構(gòu)建蛋白質(zhì)芯片,比較反應(yīng)后的信號(hào)值,得出優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.根據(jù)優(yōu)選出的條件,構(gòu)建ABO/Rh血型正反定型蛋白質(zhì)芯片。取標(biāo)準(zhǔn)抗A、抗B單克隆抗體和多人份混合A型、B型、O型Rh(D)紅細(xì)胞,分別用標(biāo)本稀釋液作等倍稀釋,用血型芯片進(jìn)行檢測(cè),分析該方法的檢測(cè)

4、靈敏度,并與試管法進(jìn)行比較。用血型芯片對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行4次重復(fù)檢測(cè),比較檢測(cè)結(jié)果的組內(nèi)和組間差異。最后,用構(gòu)建的血型芯片對(duì)30例臨床健康獻(xiàn)血者的血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),與試管法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比,分析該血型芯片的準(zhǔn)確性與特異性。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)三種基片表面蛋白質(zhì)固定率的比較,發(fā)現(xiàn)氧化型瓊脂糖基片固定效率最高(P<0.05)。比較反應(yīng)后各基片表面的信號(hào)值發(fā)現(xiàn),醛基基片上固定的蛋白質(zhì)幾乎沒(méi)有活性,且信號(hào)背景較高;氧化型瓊脂糖基片上固

5、定的蛋白質(zhì)反應(yīng)性最好,高分子三維基片D次之,并且氧化型瓊脂糖基片上樣點(diǎn)更均一,因此選擇氧化型瓊脂糖基片作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基片。經(jīng)過(guò)比較獲得優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件:以1％的瓊脂糖溶液制作基片,用30%的甘油-PBS將蛋白質(zhì)稀釋到100μg/ml進(jìn)行點(diǎn)樣,在24℃固定8h,再用1mg/ml的BSA封閉,芯片構(gòu)建好后置于4℃冰箱保存,反應(yīng)的最后一步用0.05%的PBST倒置搖洗,再用去離子水洗滌。
　　2.用構(gòu)建的血型芯片檢測(cè)倍比稀釋的血液標(biāo)本,結(jié)

6、果顯示該芯片法用于血型的檢測(cè),正定型效價(jià)可達(dá)1:8192,反定型效價(jià)可達(dá)到1:4096,而試管法對(duì)于同一標(biāo)本的檢測(cè)正定型效價(jià)為1:256,反定型效價(jià)為1:16。對(duì)重復(fù)性檢測(cè)的每張芯片內(nèi)和各芯片間平行點(diǎn)的變異系數(shù)進(jìn)行分析,組內(nèi)和組間變異系數(shù)在14%~22%之間。對(duì)于臨床標(biāo)本的檢測(cè),芯片法和試管法的結(jié)果判定都一致:A型7例, B型6例, O型12例, AB型5例,而Rh(D)血型測(cè)定結(jié)果有陰性3例,其余全為陽(yáng)性。芯片法檢測(cè)結(jié)果樣點(diǎn)較清晰,無(wú)