橢偏光蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)載脂蛋白B的研究.pdf

1、目的： 橢偏光蛋白芯片技術(shù)是將高分辨率的光學(xué)生物顯微成像技術(shù)和集成化多元蛋白質(zhì)芯片技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展形成的一種具有無(wú)標(biāo)記、高通量、實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)的蛋白質(zhì)自動(dòng)分析技術(shù)。本研究通過(guò)摸索芯片制備，探針裝配和生物學(xué)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，初步試驗(yàn)橢偏光蛋白芯片定量檢測(cè)載脂蛋白B(ApoB)的生物學(xué)檢測(cè)方法。檢測(cè)ApoB標(biāo)準(zhǔn)品以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步檢測(cè)血清中的ApoB濃度，并與臨床上現(xiàn)行檢測(cè)方法的結(jié)果作對(duì)比，以評(píng)估橢偏光蛋白芯片用于臨

2、床檢測(cè)ApoB的可行性，拓展橢偏光蛋白芯片的新用途；另一方面同時(shí)也是探索了ApoB檢測(cè)的一種新方法。 方法： 實(shí)驗(yàn)采用橢偏光學(xué)生物顯微成像系統(tǒng)，芯片裝置、微流控芯片加樣系統(tǒng)，光學(xué)蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)及軟件等。主要實(shí)驗(yàn)材料有：?jiǎn)尉Ч杵⒈砻娓男詣?、人apoB、單克隆山羊抗人apoB抗體(anti-apoB)、人血清白蛋白(HSA)、蛋白G及16例查體者的血清等。硅片處理及硅片表面羧基化改性后制備蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片(4×6點(diǎn)芯片)：裝

3、配蛋白G、裝配檢測(cè)探針(anti-apoB，濃度為0.3mg/ml)、HSA封閉檢測(cè)位點(diǎn)及依次分別沖洗，檢測(cè)樣品(apoB標(biāo)準(zhǔn)品和40倍稀釋待測(cè)血清)量為10μl，最后，橢偏光學(xué)檢測(cè)芯片成像。檢測(cè)的apoB標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度為：200、100、50、20、10、5μg/ml，依據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制濃度-灰度標(biāo)準(zhǔn)曲線并求解對(duì)應(yīng)公式。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)16例查體者的血清apoB濃度，并與免疫比濁法檢測(cè)的apoB參考濃度作比較。采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)

4、軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：根據(jù)配基濃度選擇實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定了檢測(cè)探針的濃度為0.3mg/ml，可以較好滿足檢測(cè)要求；裝配有蛋白G(定向固定作用)后的探針結(jié)合樣品灰度值與對(duì)照組比較有明顯增加，證實(shí)蛋白G的定向固定有改善檢測(cè)效果的作用。apoB標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果顯示，apoB各濃度梯度(200、100、50、20、10、5μg/ml)與位點(diǎn)灰度值具有濃度-灰度的一致性，并呈對(duì)數(shù)關(guān)系，由此做出了定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，

5、檢測(cè)靈敏度達(dá)到5μg/ml，遠(yuǎn)超出臨床檢測(cè)apoB的靈敏度要求。各組實(shí)驗(yàn)之間經(jīng)t檢驗(yàn)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。對(duì)16例健康查體者血清中的apoB濃度的檢測(cè)結(jié)果與免疫比濁法檢測(cè)的apoB參考濃度值之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，說(shuō)明了兩種檢測(cè)方法的結(jié)果之間具有一致性。 結(jié)論： 建立了基于橢偏光蛋白芯片技術(shù)的apoB蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)方法，包括硅片表面羧基化改性、使用蛋白G定向固定檢測(cè)探針等技術(shù)