Glypican-3適配子對(duì)肝癌診斷價(jià)值的研究.pdf

1、背景與目的：
　　肝癌的篩查性診斷主要依賴甲胎蛋白（alpha fetoprotein,AFP）及影像學(xué)檢查，但效果不理想。30％～40%肝癌患者血清AFP呈陰性，小肝癌多為AFP陰性肝癌，且影像學(xué)診斷具有一定的困難。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3,GPC3）在肝癌組織呈特異性高表達(dá)，并可釋放入血作為肝癌標(biāo)志物，對(duì)肝癌的篩查性診斷可能具有良好的應(yīng)用價(jià)值。目前一般采用免疫學(xué)方法測(cè)定血清GPC3水平，因其檢測(cè)敏感性差而難以

2、臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。適配子是生物分子的人工核酸配體，具有與靶標(biāo)高特異性、高親和力結(jié)合的特點(diǎn)，用于疾病診斷具有良好的應(yīng)用前景。本課題組在前期研究中通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）成功篩選出一批GPC3適配子，并建立了基于熒光分析的適配子診斷應(yīng)用技術(shù)。本研究將在前期工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步評(píng)價(jià)這些適配子在肝癌診斷中的價(jià)值，以期為

3、肝癌的診斷開(kāi)辟新途徑。
　　方法：
　　1．血清標(biāo)本及臨床資料收集：收集南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2013~2014年就診的原發(fā)性肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者及參加健康體檢的正常人血清標(biāo)本，-80℃保存?zhèn)溆?。收集包括性別、年齡、肝功能、血清腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)檢查、病理檢查等臨床資料。
　　2.GPC3適配子對(duì)肝癌診斷價(jià)值的初篩分析：人工合成20個(gè)GPC3適配子，將它們分別與肝癌、肝硬化血清標(biāo)本各48例孵育，測(cè)定孵育前后的熒光值

4、，通過(guò)受試者工作特征（Receiver operator characteristic,ROC）曲線評(píng)價(jià)單項(xiàng)熒光指標(biāo)和多項(xiàng)熒光指標(biāo)Logistic回歸建模對(duì)肝癌的診斷價(jià)值，優(yōu)選2個(gè)對(duì)肝癌診斷價(jià)值最佳的適配子進(jìn)行后續(xù)研究。
　　3．GPC3適配子診斷肝癌的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化：以不同的適配子用量和核酸染料用量組合成6種實(shí)驗(yàn)條件，在各種條件下將優(yōu)選出的2個(gè)GPC3適配子分別與肝癌、肝硬化血清標(biāo)本各32例孵育，測(cè)定孵育前后的熒光值，ROC曲線評(píng)

5、價(jià)各條件下適配子對(duì)肝癌診斷的價(jià)值，以診斷價(jià)值最大者為最佳實(shí)驗(yàn)條件。
　　4．適配子對(duì)肝癌診斷價(jià)值的評(píng)價(jià)：在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用優(yōu)選出的2個(gè)適配子分別與小樣本肝癌、肝硬化血清標(biāo)本（各80例）孵育，測(cè)定孵育前后的熒光值，ROC曲線分析單指標(biāo)及多指標(biāo)Logistic回歸分析建模對(duì)肝癌的診斷價(jià)值。將單指標(biāo)ROC曲線下面積（Area under ROC curve，AUROC）達(dá)到0.8、多指標(biāo)達(dá)0.9以上的適配子擴(kuò)大樣本量及樣本類型進(jìn)行分析

6、（肝癌、肝硬化、肝炎和正常血清標(biāo)本例數(shù)各100例以上）。ROC曲線分析單項(xiàng)熒光指標(biāo)、多項(xiàng)熒光指標(biāo)Logistic回歸建模、適配子聯(lián)合聯(lián)合建模對(duì)肝癌的診斷價(jià)值，并計(jì)算適配子對(duì)肝癌的診斷效率（敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、預(yù)測(cè)值和似然比）。
　　5．血清GPC3的ELISA檢測(cè)及診斷價(jià)值評(píng)價(jià)：以商業(yè)化的人GPC3的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒同步檢測(cè)肝癌、肝硬化

7、各80例血清標(biāo)本中的GPC3濃度，評(píng)價(jià)其對(duì)肝癌診斷價(jià)值。
　　6．血清腫瘤標(biāo)志物對(duì)肝癌的診斷價(jià)值：收集各標(biāo)本的血清AFP、CEA、CA125和CA19-9檢測(cè)結(jié)果，ROC曲線評(píng)價(jià)標(biāo)志物單項(xiàng)和聯(lián)合分析對(duì)肝癌的診斷價(jià)值。
　　結(jié)果：
　　1．GPC3適配子對(duì)肝癌診斷價(jià)值的初篩結(jié)果及適配子檢測(cè)肝癌的最優(yōu)條件：20個(gè)適配子中，9個(gè)適配子單項(xiàng)熒光指標(biāo)診斷肝癌的最大AUROC達(dá)0.8以上；16個(gè)適配子多項(xiàng)熒光指標(biāo)聯(lián)合分析診斷肝癌的

8、AUROC達(dá)0.9以上，其中AP-GPC3-13、AP-GPC3-27兩個(gè)適配子的AUROC分別為0.999與0.995，為優(yōu)選適配子。兩個(gè)優(yōu)選適配子AP-GPC3-13、AP-GPC3-27在適配子及核酸染料用量分別在0.3pmol、2.5μL及0.5pmol、2.5μL條件下診斷肝癌的價(jià)值最大，為最佳條件。
　　2.GPC3適配子對(duì)肝癌的診斷價(jià)值：小樣本血清標(biāo)本（肝癌、肝硬化各80例）分析上述2個(gè)優(yōu)選適配子對(duì)肝癌診斷價(jià)值，最佳

9、單指標(biāo)AUROC分別為0.852及0.884，優(yōu)于AFP；多指標(biāo)聯(lián)合分析AUROC均為0.9以上，明顯優(yōu)于AFP。擴(kuò)大樣本（肝癌、肝硬化、肝炎和正常血清分別為144、158、126、100例，肝硬化、慢性肝炎與正常合并為非肝癌組）評(píng)價(jià)2個(gè)適配子對(duì)肝癌的診斷價(jià)值，最佳單指標(biāo)診斷肝癌與非肝癌的AUROC為0.75左右，多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)為0.9左右。2個(gè)適配子聯(lián)合分析診斷肝癌與非肝癌的AUROC、敏感度、特異度、準(zhǔn)確度均達(dá)0.9以上，優(yōu)于單一適

10、配子。
　　在55例小肝癌（≤3cm）中，兩個(gè)適配子的檢測(cè)陽(yáng)性率分別為63.6%和49.1%，高于AFP（43.6%）；兩者聯(lián)合分析陽(yáng)性率進(jìn)一步提高，達(dá)74.5%。在68例AFP陰性肝癌，兩個(gè)適配子的檢測(cè)陽(yáng)性率分別為70.6%和69.1%，兩者聯(lián)合分析達(dá)83.8%。
　　3．ELISA檢測(cè)血清GPC3對(duì)肝癌的診斷價(jià)值：肝癌組的血清GPC3水平為1.22±3.07ng/mL，肝硬化組的血清 GPC3水平為1.36±3.35ng

11、/mL，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，診斷肝癌的AUROC為0.575。
　　4．腫瘤標(biāo)志物對(duì)肝癌的診斷價(jià)值：在4組血清標(biāo)本中，只有 AFP對(duì)肝癌具有一定的診斷價(jià)值，診斷肝癌與非肝癌的AUROC為0.761，其他腫瘤標(biāo)志物（CEA、CA125、CA199）無(wú)明顯診斷價(jià)值，4種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷肝癌的AUROC無(wú)明顯增加。
　　結(jié)論：
　　1．GPC3適配子對(duì)肝癌具有良好的診斷價(jià)值，明顯優(yōu)于血清GPC3和AFP檢測(cè)對(duì)肝癌的診斷