SELEX技術(shù)篩選泡沫細(xì)胞適配子.pdf

1、目的:利用SELEX技術(shù)篩選靶向巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的寡核苷酸適配子,并初步鑒定其與巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞及動(dòng)脈粥樣硬化病變結(jié)合的特異性。
　　方法:體外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞,經(jīng)100nmol/L PMA孵育72小時(shí),誘導(dǎo)其分化成巨噬細(xì)胞,然后用80mg/L氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)孵育72小時(shí),建立泡沫細(xì)胞模型,通過(guò)油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴,HPLC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。體外合成一個(gè)含35個(gè)核苷酸隨機(jī)序列、總長(zhǎng)81nt、庫(kù)容

2、量大約為1015-16的ssDNA文庫(kù);優(yōu)化了ssDNA庫(kù)PCR反應(yīng)條件,用生物素和FITC標(biāo)記的引物擴(kuò)增為dsDNA文庫(kù)并以生物素-鏈霉親和素磁珠分離方法構(gòu)建FITC標(biāo)記的ssDNA文庫(kù);以六孔板為篩選介質(zhì),ssDNA文庫(kù)先分別與大鼠血管平滑肌細(xì)胞和THP-1巨噬細(xì)胞結(jié)合,反篩除去與其結(jié)合的ssDNA,然后與巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞結(jié)合,洗脫與其結(jié)合的ssDNA,PCR擴(kuò)增構(gòu)建次級(jí)FITC標(biāo)記的ssDNA文庫(kù)進(jìn)行下一次篩選。利用熒光顯微鏡

3、觀察每輪FITC標(biāo)記的ssDNA文庫(kù)與大鼠血管平滑肌細(xì)胞、THP-1巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞結(jié)合的情況。將最后一輪篩選后得到的ssDNA用無(wú)標(biāo)記的引物PCR擴(kuò)增,轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌中克隆和測(cè)序。應(yīng)用DNA MAN軟件和RNA structer4.2軟件對(duì)每一個(gè)適配子的保守序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,篩選出文庫(kù)中富集程度最高、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)最明顯的適配子進(jìn)行體外合成,FITC標(biāo)記后,利用熒光顯微觀察及PCR方法鑒定其與巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞

4、及動(dòng)脈粥樣硬化病變結(jié)合的特異性。
　　結(jié)果:1、THP-1細(xì)胞經(jīng)oxLDL處理后,油紅O染色觀察到細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯增多,HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇含量顯著增加,由6.5±3.8 ug/mg升至103.7±3.6ug/mg,膽固醇脂/總膽固醇大于50％,說(shuō)明泡沫細(xì)胞模型建立成功。
　　2、通過(guò)條件優(yōu)化,確立以退火溫度72℃為基礎(chǔ)的ssDNA文庫(kù)PCR反應(yīng)條件,用FITC、Biotin標(biāo)記的引物可擴(kuò)增為dsDNA。標(biāo)記有FIT

5、C和Biotin的dsDNA經(jīng)鏈親和素磁珠結(jié)合、0.15mol/L的NaOH變性后,可制備出產(chǎn)物量大,純度高,符合SELEX篩選要求的FITC標(biāo)記ssDNA文庫(kù)。
　　3、SELEX篩選過(guò)程中,隨著篩選輪數(shù)的增加,文庫(kù)中寡核苷酸與泡沫細(xì)胞結(jié)合的特異性逐漸增強(qiáng)。經(jīng)過(guò)18輪篩選,與泡沫細(xì)胞結(jié)合的ssDNA得到了富集和進(jìn)化,而隨機(jī)文庫(kù)中的ssDNA幾乎不再與平滑肌細(xì)胞、THP-1巨噬細(xì)胞結(jié)合。
　　4、將第18輪篩選后得到的ssD

6、NA PCR擴(kuò)增后克隆測(cè)序,發(fā)現(xiàn)所有的適配子的一級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有共同的同源序列,但可以分為12個(gè)家族:家族1含有保守序列CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT,家族2含有保守序列 TGGTG,家族3兩條序列完全一致,家族4含有保守序列CGTGG,家族5含有保守序列TTGTG,家族6含有保守序列GGCCC,家族7含有保守序列GGGTG,家族8含有保守序列TGTGTGG,家族9含有保守序列TTGGC,家族10含有保守序列TCTGCT,

7、家族11含有保守序列CCACGG,家族12共5個(gè)無(wú)保守序列。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明,適配子主要形成莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)特征可能是適配子與巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　5、通過(guò)對(duì)適配子一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,篩選出文庫(kù)中富集程度最高、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)最明顯23號(hào)和40號(hào)適配子并進(jìn)行FITC標(biāo)記。通過(guò)熒光顯微觀察發(fā)現(xiàn)23號(hào)和40號(hào)適配子能特異性結(jié)合巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞,而不與血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合;通過(guò)PCR