肝癌血清核酸適配子的篩選及其鑒定.pdf

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特另tlDN以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得南昌大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名(手寫)：誨鹽驢簽字同期：加『J年占月，尹日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論

2、文作者完全了解南昌大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)南昌大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編本學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會(huì)公眾提供信息服務(wù)。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名(手寫)：傅&嘻導(dǎo)師簽

3、名(手寫)：吾長脅簽字同期：pff年石月嘩日簽字日期：≯t7年苦月I2／日學(xué)位淪文作者畢業(yè)后去向：工作單位：茹塘豹悶中唐醫(yī)阮通訊地址：南昌爭胤素泉醒習(xí)7堇電話：D77t∽二緲郵編：弓叫摘要對測序結(jié)果進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的模擬分析，采用Clustal軟件對適配子序列進(jìn)行聚類分析，劃分家族，同一家族進(jìn)行同源性比對。(6)適配子的特異性分析：將梯度適配子量(2～6pm01)分別與肝癌混合血清、正?；旌涎宸跤ㄟ^聚丙烯酰胺凝膠阻滯電泳觀察結(jié)合情況，

4、QuantityOne凝膠分析軟件測定游離適配予帶的灰度值，并計(jì)算『F常混合血清與肝癌混合血清游離適配子的灰度比值，評價(jià)適配子與肝癌血清結(jié)合的特異性。(7)適配子的親和力分析：將梯度量(1Spm01)的適配子與肝癌混合血清孵育結(jié)合、聚丙烯酰胺凝膠阻滯電泳后測定結(jié)合條帶灰度值，采用Graphpadprism501軟件測定解離常數(shù)(Kd)。(8)適配子與單個(gè)肝癌血清標(biāo)本結(jié)合的特異性分析：選擇代表性適配子與單個(gè)肝癌血清標(biāo)本和正常血清標(biāo)本孵育、

5、聚丙烯酰胺凝膠阻滯電泳觀察結(jié)合適配子與血清結(jié)合情況，測定游離帶灰度值，計(jì)算其與適配子對照的比值，ROC曲線評估適配子對肝癌的診斷價(jià)值。結(jié)果：(1)肝癌混合血清適配子篩選與分離：經(jīng)過3輪消減篩選，與正常血清結(jié)合的核酸減少；經(jīng)過9輪正向SELEX篩選，亞文庫通過克隆成功分離出209個(gè)核酸序列，它們兩端序列固定，與文庫序列相同，中間的序列各不相同，表明成功篩選出一組肝癌血清適配子。(2)適配子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：適配子的二級結(jié)構(gòu)模擬分析顯示，結(jié)構(gòu)豐富

6、，主要有口袋形、發(fā)卡形、棒形和球拍形等；序列聚類分析分析顯示，適配子分為3個(gè)家族，同源性序列比對發(fā)現(xiàn)有多個(gè)保守基序。(3)適配子的特異性分析：多數(shù)適配子與肝癌血清的結(jié)合帶明顯強(qiáng)于正常血清，而游離帶則相反，游離適配子帶的最大比值在107～661之間，平均190：t：077，表明適配子與肝癌血清有不同程度的特異性結(jié)合。(4)適配子的親和力分析：選擇了具有明顯結(jié)合條帶的10個(gè)適配子進(jìn)行親和力分析，Kd值介于46nM640nM之間，表明多數(shù)適配

7、子與肝癌混合血清具有較好的親和力。(5)適配子與單個(gè)血清標(biāo)本的結(jié)合情況：選擇了兩個(gè)代表性適配子進(jìn)行觀察，適配子HCS—AP一9—25的ROC曲線下面積是0969，敏感性為941％，特異性為941％，適配子HCS—AP9—41的ROC曲線下面積是0945，敏感性941％，特異性為882％。結(jié)論：本研究得出以下結(jié)論：(1)首次以肝癌血清為靶標(biāo)進(jìn)行復(fù)合靶消減SELEX篩選，并分離出200多條與文庫吻合的核酸序列，表明成功建立起以血清為靶標(biāo)的適