承載MSCs納米纖維補(bǔ)片移植治療心肌梗死和Tβ4過(guò)表達(dá)對(duì)內(nèi)源性心肌修復(fù)的促進(jìn)作用.pdf

1、目的:心肌梗死嚴(yán)重威脅著人們的生命與健康，給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。迄今為止，對(duì)于心肌梗死的治療尚無(wú)理想措施。干細(xì)胞移植是目前最有前景的治療手段，但仍存在移植后細(xì)胞存活率低、難以向心肌細(xì)胞分化等關(guān)鍵性問(wèn)題，這嚴(yán)重地影響了干細(xì)胞移植治療的效果。因此，制定有效地干細(xì)胞移植治療措施是亟待解決的首要問(wèn)題。本研究利用承載MSCs或Tβ4過(guò)表達(dá)MSCs(Tβ4-MSCs)的納米纖維補(bǔ)片移植治療心肌梗死，探討PG納米纖維補(bǔ)片和Tβ4過(guò)表達(dá)對(duì)外

2、源性和內(nèi)源性心肌修復(fù)的促進(jìn)作用及其機(jī)制，以期為干細(xì)胞移植治療的深入開(kāi)展和臨床應(yīng)用提供新思路和可行性實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:采用高分子材料PCL和天然生物材料明膠靜電紡絲制備PG納米纖維，利用體外三維培養(yǎng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)PG納米纖維與細(xì)胞的相容性。通過(guò)建立體外低氧模型模擬體內(nèi)缺血缺氧微環(huán)境，評(píng)價(jià)低氧和營(yíng)養(yǎng)剝奪條件下PG對(duì)MSCs存活及增殖活性的影響。建立雌性大鼠心肌梗死模型，于梗死后1周移植承載表達(dá)GFP的雄性大鼠MSCs的PG納米纖維補(bǔ)片。

3、移植后4周通過(guò)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能變化。用HE和Masson三色染色觀察大鼠左心室壁的形態(tài)和組織學(xué)變化，測(cè)量左心室壁厚度。采用CD31免疫熒光染色檢測(cè)微血管密度，評(píng)價(jià)梗死組織的血管新生。用LYVE-1免疫熒光染色檢測(cè)淋巴管，評(píng)價(jià)梗死邊緣區(qū)淋巴管新生。采用cTnT和Cx43免疫熒光染色檢測(cè)梗死組織內(nèi)的心肌再生、分布特點(diǎn)和相互之間的連接。利用Y染色體示蹤和GFP追蹤移植細(xì)胞的存活和分布，同時(shí)采用PCR法檢測(cè)Sry基因DNA含量，綜合評(píng)價(jià)

4、PG對(duì)移植細(xì)胞存活的促進(jìn)作用，用CD31和cTnT免疫熒光法檢測(cè)移植細(xì)胞向內(nèi)皮和心肌細(xì)胞的分化。此外，為進(jìn)一步明確PG承載MSCs移植促進(jìn)心肌修復(fù)的作用機(jī)制，采用Wt1和c-Kit免疫熒光法檢測(cè)心外膜源性細(xì)胞(EPDCs)和內(nèi)源性心肌干細(xì)胞在梗死組織的分布和分化。為了進(jìn)一步探索內(nèi)源性心肌修復(fù)在心肌梗死治療中的作用及其機(jī)制，采用Tβ4基因轉(zhuǎn)染MSCs，然后用承載Tβ4-MSCs的PG納米纖維補(bǔ)片移植治療大鼠心肌梗死，檢測(cè)大鼠心功能變化和心

5、臟形態(tài)學(xué)變化。免疫熒光法檢測(cè)補(bǔ)片移植后MSCs的存活和分化以及Tβ4過(guò)表達(dá)對(duì)內(nèi)源性干細(xì)胞的激活和動(dòng)員作用。
　　結(jié)果:PG納米纖維呈現(xiàn)多孔性，纖維直徑為244±51nm，孔隙率為83.06±0.8％，孔徑為0.83±0.15μm。體外三維模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MSCs能夠在PG納米纖維膜上很好地鋪展和相互聯(lián)系。細(xì)胞骨架排列有序，與細(xì)胞的伸展方向基本一致。在低氧和無(wú)血清培養(yǎng)條件下PG能夠促進(jìn)細(xì)胞存活和提高細(xì)胞活性。在大鼠心肌梗死模型，用

6、承載MSCs的PG納米纖維補(bǔ)片移植能夠明顯地改善大鼠心功能、縮小瘢痕面積、增加左心室壁厚度、促進(jìn)血管新生、減少淋巴管新生和促進(jìn)心肌再生。PG納米纖維能夠顯著提高移植細(xì)胞的存活率。Y染色體示蹤和GFP追蹤結(jié)果顯示，PG可促進(jìn)移植細(xì)胞向心肌和內(nèi)皮細(xì)胞分化。用承載MSCs的PG納米纖維補(bǔ)片移植，觀察到梗死組織內(nèi)Wt1和c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞增多，部分細(xì)胞表達(dá)cTnT，提示承載MSCs的PG納米纖維補(bǔ)片在激活和動(dòng)員內(nèi)源性干細(xì)胞參與心肌修復(fù)方面發(fā)揮重

7、要作用。Tβ4基因轉(zhuǎn)染MSCs后能夠促進(jìn)其過(guò)表達(dá)和分泌Tβ4。用承載Tβ4-MSCs的PG納米纖維補(bǔ)片移植，觀察到大鼠心功能得到進(jìn)一步改善，左心室壁厚度明顯增加。Tβ4過(guò)表達(dá)明顯促進(jìn)MSCs移植后的存活和分化，同時(shí)顯著增加Wt1和c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞向梗死組織的募集，大部分Wt1和c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞位于心外膜下層和心肌組織中，部分Wt1和c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)cTnT，這提示W(wǎng)t1和c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞能夠分化為心肌細(xì)胞。
　　結(jié)論:

8、PG納米纖維具有良好的生物相容性和與心肌組織相適應(yīng)的彈性系數(shù)，是一種良好的心肌組織工程納米材料。PG納米纖維能夠保護(hù)細(xì)胞免受低氧損傷，從而提高在缺血缺氧條件下的細(xì)胞存活率。用承載MSCs的PG納米纖維補(bǔ)片移植能夠有效地限制左心室擴(kuò)張，促進(jìn)移植細(xì)胞存活，并有利于移植細(xì)胞向內(nèi)皮和心肌細(xì)胞分化。承載MSCs的PG納米纖維補(bǔ)片能夠有效地激活心外膜源性細(xì)胞和動(dòng)員心肌干細(xì)胞參與內(nèi)源性心肌修復(fù)，從而能夠顯著提高干細(xì)胞移植修復(fù)梗死心肌的效果。Tβ4過(guò)表