殼聚糖-絲素蛋白納米纖維補(bǔ)片聯(lián)合脂肪間充干細(xì)胞促進(jìn)心肌修復(fù)的實驗研究.pdf

1、目的：
　　世界衛(wèi)生組織（WHO）最新數(shù)據(jù)顯示，2012年，全球有約740萬人死于缺血性心臟病（ischemia heart disease，IHD），占總死亡人數(shù)的13.2％，高居全部死亡病因之首。人類在出生后不久心肌就喪失了有效的再生能力，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)發(fā)生后，壞死的心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆死亡，由瘢痕組織（scar tissue）所取代，在心室腔的持續(xù)負(fù)荷下，發(fā)生心室

2、重構(gòu)（ventricular remodeling）并最終發(fā)展為心力衰竭（heart failure，HF）。經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)（PCI）、冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）及藥物溶栓等手段的應(yīng)用大大地降低了AMI的早期死亡率，但HF發(fā)生率及遠(yuǎn)期死亡率仍居高不下。因此，臨床亟待建立一種促進(jìn)心肌再生、抑制心室重構(gòu)的治療手段。
　　研究顯示，干細(xì)胞治療可以促進(jìn)心肌再生，改善心功能。但局部缺氧環(huán)境和炎癥反應(yīng)等因素，使移植干細(xì)胞的存活率極低，

3、因而限制了其臨床應(yīng)用。所以，提高干細(xì)胞存活率是干細(xì)胞治療的關(guān)鍵。基于組織工程技術(shù)的心肌補(bǔ)片（cardiac patch）模擬細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），為移植干細(xì)胞的存活和增殖提供優(yōu)化的微環(huán)境（microenvironment），可提高干細(xì)胞的存活率。此外，有研究證實，用聚丙烯網(wǎng)片（marlex mesh）限制 AMI后的心臟擴(kuò)大，可抑制左室重構(gòu)，改善心功能，并延緩HF的發(fā)生。因此，作為干細(xì)胞載體并為心室提供機(jī)械支撐的心肌補(bǔ)片有可能成為干細(xì)胞

4、治療的理想模式。
　　心肌補(bǔ)片是干細(xì)胞滲透、趨化、定植和增殖分化的載體和支架，同時也為心室提供適當(dāng)?shù)臋C(jī)械支撐而限制心室的擴(kuò)張，因此，材料的選擇和設(shè)計極為關(guān)鍵。纖維素是自然界含量極為豐富的天然高分子多糖，有很好的生物相容性，也具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，可為心室提供穩(wěn)定的機(jī)械支撐，通過靜電紡絲技術(shù)將其制備成納米纖維膜，具有互相貫通的三維結(jié)構(gòu)，利于營養(yǎng)物質(zhì)的輸送和細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)，從微觀結(jié)構(gòu)上看，是作為組織工程補(bǔ)片的理想材料。然而，纖維素結(jié)構(gòu)

5、穩(wěn)定，親水性欠佳。層層自組裝技術(shù)（LBL）利用正負(fù)電荷的相互作用而形成多層自組裝體系，能有效地構(gòu)建生物活性表面，用生物相容性更好的絲素蛋白（SF）和殼聚糖（CS），利用LBL技術(shù)使其在纖維素納米纖維表面形成多層生物活性膜，可大大地提高其生物相容性。
　　脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AD-MSCs）大量存在于脂肪組織，取材方便，體外培養(yǎng)活性好，無倫理學(xué)問題，免疫原性低，旁分泌作用和分化能力強(qiáng)，且不產(chǎn)生畸胎瘤，是組織再生理想的種子細(xì)胞，具有良好

6、的臨床應(yīng)用前景。
　　因此，本課題擬利用靜電紡絲技術(shù)和LBL技術(shù)，制備CS/SF改性的納米纖維膜作為心肌補(bǔ)片，用穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶（Fluc）和綠色熒光蛋白（GFP）的AD-MSCs作為種子細(xì)胞，將兩者進(jìn)行三維共培養(yǎng)后用于AMI的心肌組織工程修復(fù)，并探討其對AMI后的心肌修復(fù)作用及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步臨床研究提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1．醋酸纖維素（CA，Mn=3×104 Da）在16 kV的直流電壓下靜

7、電紡絲16 h制備醋酸纖維素納米纖維膜，在0.05 mol/L氫氧化鈉溶液中水解7 d得到纖維素納米纖維膜。通過LBL技術(shù)使帶正電荷的CS和帶負(fù)電荷的SF在纖維素納米纖維表面形成多層膜結(jié)構(gòu)。電位測定儀測定CA、CS和SF的ζ-電位，X射線光電子能譜（XPS）確定納米纖維膜構(gòu)建成功，掃描電子顯微鏡（SEM）觀察納米纖維膜的微觀結(jié)構(gòu)。
　　2．無菌條件下取小鼠精囊腺及腎周脂肪組織，用酶消化法分離培養(yǎng) AD-MSCs，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

8、，生物發(fā)光成像（BLI）確定Fluc的活性與細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性，流式細(xì)胞術(shù)鑒定AD-MSCs特征性標(biāo)志物。
　　3．取第2~5代對數(shù)生長期AD-MSCs與不同（CS-SF）層數(shù)的納米纖維膜進(jìn)行共培養(yǎng)，評估其生物相容性，以選擇合適的（CS-SF）的LBL層數(shù)。共培養(yǎng)后，激光共聚焦顯微鏡（CFM）觀察細(xì)胞生長形態(tài)，掃描電子顯微鏡（SEM）觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，MTT比色法評估細(xì)胞的增殖活性。
　　4．將 SD大鼠隨機(jī)分為四組，分別為：

9、1.急性心肌梗死組（MI），在大鼠左心耳下緣3㎜處結(jié)扎冠狀動脈前降支，建立AMI模型；2.假手術(shù)組（Sham），縫線前降支下穿過但不結(jié)扎；3.心肌梗死+心肌補(bǔ)片組（MI+Patch），建立AMI模型的同時給予心肌補(bǔ)片治療；4.心肌梗死+心肌補(bǔ)片+AD-MSCs組（MI+Patch/AD-MSCs），建立AMI模型的同時給予種植有AD-MSCs的心肌補(bǔ)片治療。24h后，取大鼠心臟進(jìn)行伊文氏藍(lán)-TTC染色，比較各組大鼠的心梗面積大小。

10、>　　5．術(shù)后24h，TUNEL染色測定各組心肌細(xì)胞凋亡。術(shù)后3d、7d、14d、28d，用小動物超聲進(jìn)行心功能監(jiān)測，BLI對移植 AD-MSCs進(jìn)行在體示蹤。28d后，馬松染色確定心肌瘢痕面積和纖維化程度，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31免疫組化染色檢測梗死周圍區(qū)的血管新生。
　　研究結(jié)果：
　　1.通過靜電紡絲技術(shù)和LBL技術(shù)，成功制備CS/SF納米纖維膜。CA、CS、SF的ζ-電位在pH為6.04、6.44和6.84條件下，分別

11、為﹣21.3、﹢25.4和﹣10.2（mV），提示CS、SF可通過電荷作用自組裝到纖維素納米纖維表面。XPS測定的結(jié)果提示CS/SF納米纖維膜構(gòu)建成功。納米纖維在SEM下直徑均一，具有良好的三維多孔結(jié)構(gòu)。
　　2.成功分離培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)Fluc和GFP的AD-MSCs，普通光鏡下，細(xì)胞呈梭形貼壁生長，胞漿透明、清亮，熒光顯微鏡下可見 GFP分布均勻，綠色熒光信號強(qiáng)。Fluc的信號強(qiáng)度隨細(xì)胞數(shù)量的增加而增加，定量分析顯示信號強(qiáng)度與細(xì)胞

12、數(shù)量呈線性相關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)顯示本實驗分離培養(yǎng)的AD-MSCs胞膜CD44、CD90呈雙陽性表達(dá)，CD34、CD45呈雙陰性表達(dá)，為AD-MSCs的特征性標(biāo)記物。
　　3. SEM可見AD-MSCs在10.5層（CS-SF）的納米纖維膜上增殖活躍，生長形態(tài)和狀態(tài)良好。CFM及MTT比色法的結(jié)果提示AD-MSCs與10.5層（CS-SF）的納米纖維膜共培養(yǎng)后呈三維分布，增殖狀態(tài)好。通過對不同（CS-SF）層數(shù)的納米纖維膜的生物相容性進(jìn)

13、行對比，發(fā)現(xiàn)10.5層（CS-SF）的納米纖維膜生物相容性最好，故在動物實驗中選擇10.5層（CS-SF）的納米纖維膜用于心肌補(bǔ)片。
　　4.結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支后，結(jié)扎線以下心肌蒼白，心電監(jiān)護(hù)顯示ST-T段抬高。補(bǔ)片通過自身黏附作用牢固地黏附在心外膜表面，4w后已與心外膜融合。伊文氏藍(lán)-TTC染色顯示AMI模型構(gòu)建成功且各組的心梗面積大小無差別。
　　5. TUNEL染色顯示MI+Patch/AD-MSCs組心肌細(xì)胞凋亡

14、最為明顯。超聲心動圖結(jié)果表明，MI+Patch/AD-MSCs組心臟收縮功能和心室重構(gòu)的改善作用更為顯著。BLI結(jié)果表明，移植的AD-MSCs在術(shù)后4w仍有相當(dāng)部分的存活。馬松染色提示，MI+Patch/AD-MSCs組的心肌瘢痕面積和纖維化程度最小。CD31免疫組化證實，MI+Patch/AD-MSCs組的血管新生的密度最大。
　　研究結(jié)論：
　　1.靜電絲紡技術(shù)可將纖維素制備成互相貫通的多孔三維結(jié)構(gòu)。層層自組裝技術(shù)（LB

15、L）利用正負(fù)電荷的相互作用構(gòu)建生物活性表面。使帶正電且具有抑菌和黏附作用的殼聚糖（CS）和帶負(fù)電具有彈性和緩釋作用的絲素蛋白（SF）通過正負(fù)電荷的相互作用，在纖維素納米纖維膜表面構(gòu)建多層生物活性結(jié)構(gòu)，得到改性的CS/SF納米纖維膜，通過與AD-MSCs的共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，LBL技術(shù)可增加纖維素納米纖維的生物相容性，其中，LBL10.5層（CS-SF）的納米纖維膜生物相容性最好，故將其用作心肌補(bǔ)片。
　　2.將 CS/SF納米纖維膜作為