Bufalin對裸鼠食管鱗狀細胞癌原位移植瘤mTOR-4E-BP1信號通路及凋亡的影響.pdf

1、食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，目前排在我國惡性腫瘤的第四位，在我國惡性腫瘤中占22.4％，每年約有25萬新病人產生。食管癌的臨床治療雖有進步，5年生存率仍然較低。因此，研究與食管癌發(fā)生發(fā)展相關的信號轉導通路及藥物作用的靶點來尋求新的抗腫瘤藥物，成為食管癌治療研究的重點。
　　哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及4E-BP1是磷脂酰肌醇3一激酶/蛋白激酶B(phosph

2、atidylinositol3-Kinase/proteinkinase B，P13K/PKB)信號通路的下游分子，在調節(jié)細胞生長、分化中發(fā)揮重要作用。mTOR活化后，使4E-BP1磷酸化，eIF-4E被釋放并與其他翻譯起始因子形成復合物，從而解除對翻譯的抑制作用，導致翻譯起始，加速與生長分化相關的蛋白的表達。當mTOR被抑制時，去磷酸化的4E-BP1與eIF4E結合，形成eIF4E-4EBP1復合體，抑制翻譯起始。研究表明，4E-BP

3、1的磷酸化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，因此該通路是目前研究的焦點，為臨床治療腫瘤提供新的靶點。
　　Bufalin（蟾蜍靈）是中藥蟾酥中提取的一種毒性配基，屬強心甙類物質。這種成分具有抗癌、強心、抗炎、增強免疫等作用，臨床上已廣泛應用于治療多種實體腫瘤、血液病和慢性乙肝等疾病。我們前期的體外實驗表明:Bufalin可有效抑制食管癌細胞的生長和增殖。本實驗旨在進一步探討B(tài)ufalin在食管癌動物模型中的抗腫瘤作用，為臨床應用于食管

4、癌的治療提供實驗依據。
　　目的:探討B(tài)ufalin對裸鼠食管癌原位移植瘤的抑制作用及其可能誘導凋亡的機制。
　　方法:
　　1將36只人食管癌細胞株ECA109建立的裸鼠原位移植瘤模型隨機分為模型組、Bufalin低劑量組（0.5kg/ml，BL）、中劑量組(1.0kg/ml，BM)、高劑量組(1.5kg/ml，BH)、雷帕霉素組(RAPA)、Bufalin高劑量組與雷帕霉素聯(lián)合組(BR)，每組6只，腹腔注射給藥持續(xù)

5、30天，用藥結束后全部處死36只裸鼠，完整取出腫瘤，測量裸鼠用藥前后的體重、腫瘤大小，計算腫瘤抑制率。
　　2腫瘤組織HE染色觀察腫瘤壞死程度。
　　3 RT-PCR法檢測各組mTOR、4E-BP1 mRNA的表達情況。
　　4 Western Blot及免疫組化法檢測各組mTOR、4E-BP1、Bad、Bcl-2的蛋白水平表達及4E-BP1的活化情況。
　　5流式細胞技術檢測各組移植瘤細胞的凋亡指數(shù)。
　

6、　結果:
　　1模型組、BL、BM、BH、RAPA和BR組治療前體重為20.9±2.4g、20.8±1.5g、20.8±2.1g、20.9±2.7g、20.9±1.9g、20.8±2.1g，治療后的體重為27.9±3.0g、28.2±1.9g、27.9±2.9g、28.1±2.8g、27.9±2.0g、27.8±2.6g,差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療后各組移植瘤體積分別為1.791±0.087cm3、1.720±0.08

7、8cm3、1.137±0.060cm3、0.702±0.054cm3、0.699±0.079cm3、0.506±0.076cm3，實驗組腫瘤抑制率分別為4.0％、36.5％、60.8％、61.0％、71.7％，BM、BH、RAPA、BR組腫瘤體積與模型組比較縮小(P＜0.05)，BR組腫瘤體積與其余各組比較縮小，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2腫瘤組織HE染色顯示:各組移植瘤內均可見壞死。模型組壞死少見;BL組以灶狀

8、壞死為主;BM組腫瘤組織內可見大片狀壞死;BH、RAPA及BR組均可見大面積壞死，壞死組織內可見散在癌細胞團。
　　3 RT-PCR結果顯示:模型組、BL、BM、BH、RAPA和BR組移植瘤4E-BP1 mRNA表達水平分別為1.032±0.061、1.039±0.082、1.036±0.093、1.036±0.081、1.044±0.092、1.037±0.087各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。各組移植瘤mTOR m

9、RNA表達水平分別為1.136±0.083、1.124±0.044、0.994±0.142、0.823±0.113、0.787±0.074、0.661±0.070,BM、BH、RAPA、BR組表達水平與模型組比較降低（P＜0.05），BR組表達水平與其余各組比較降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4 Western Blot結果顯示:模型組、BL、BM、BH、RAPA和BR組移植瘤mTOR蛋白表達水平分別為1.58±

10、0.121、1.52±0.110、1.03±0.141、0.81±0.150、0.79±0.110、0.61±0.171，BM、BH、RAPA、BR組表達水平與模型組比較降低（P＜0.05），BR組表達水平與其余各組比較降低(P＜0.05)。各組移植瘤4E-BP1蛋白表達水平分別為1.205±0.143、1.320±0.131、1.310±0.142、1.217±0.133、1.315±0.134、1.214±0.121, BM、BH、

11、RAPA、BR組表達水平與模型組比較降低(P＜0.05)，BR組表達水平與其余各組比較降低(P＜0.05)。各組移植瘤4E-BP1磷酸化水平分別為1.662±0.110、1.513±0.095、1.082±0.150、0.767±0.070、0.732±0.071、0.627±0.063，BM、BH、RAPA、BR組表達水平與模型組比較降低(P＜0.05)，BR組表達水平與其余各組比較降低（P＜0.05）。各組移植瘤Bad蛋白表達水平分

12、別為0.610±0.054、0.695±0.055、0.818±0.151、1.037±0.123、1.056±0.105、1.180±0.160,BM、BH、RAPA、BR組表達水平與模型組比較升高(P＜0.05)，BR組表達水平與其余各組比較升高(P＜0.05)。各組移植瘤Bcl-2蛋白表達水平分別為1.630±0.070、1.520±0.092、1.052±0.07g、0.785±0.080、0.743±0.081、0.556±0

13、.058, BM、BH、RAPA、BR組表達水平與模型組比較降低(P＜0.05)，BR組表達水平與其余各組比較降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　腫瘤組織免疫組化反應積分（染色強度與陽性百分比乘積）結果顯示:模型組、BL、BM、BH、RAPA和BR組移植瘤mTOR免疫反應積分分別為10.5±0.4、8.8±0.4g、7.3±1.0、5.0±1.1、5.0±1.1、3.0±0.6,BM、BH、RAPA、BR組表達水平與

14、模型組比較減小(P＜0.05)，BR組表達水平與其余各組比較減小(P＜0.05)。各組移植瘤4E-BP1免疫反應積分分別為7.7±1.4、8.3±1.2;7.8±1.0;7.3±1.0;8.2±1.2;7.3±1.0，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。各組移植瘤4E-BP1的免疫反應積分分別為10.0±1.5、8.7±0.5、7.0±1.1、3.5±0.5、3.7±0.5、2.5±0.5,BM、BH、RAPA、BR組表達水平與模

15、型組比較減小(P＜0.05)，BR組表達水平與其余各組比較減小(P＜0.05)。各組移植瘤Bad免疫反應積分分別為2.2±0.4、2.7±0.5、4.2±1.0、7.8±1.0、8.2±1.2、10.5±1.6,BM、BH、RAPA、BR組表達水平與模型組比較升高(P＜0.05)，BR組表達水平與其余各組比較升高（P＜0.05）。各組移植瘤Bcl-2免疫反應積分分別為10.0±1.5、8.8±0.4、7.0±1.1、3.7±0.5、3.

16、7±0.5、2.7±0.5，BM、BH、RAPA、BR組表達水平與模型組比較減小(P＜0.05)，BR組表達水平與其余各組比較減小，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5 PI染色法流式細胞術檢測細胞凋亡結果:模型組、BL、BM、BH、RAPA及BR組移植瘤凋亡指數(shù)分別為2.58±0.16％、5.48±0.27％、11.05±1.12％、23.47±1.05％、22.29±1.20％、20.32±1.06％，實驗各組凋亡指

17、數(shù)均高于模型組(P＜0.05)，以BH組凋亡指數(shù)最高，BH組凋亡指數(shù)與其余各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論:
　　1 Bufalin可有效抑制裸鼠人食管癌原位移植瘤的生長。
　　2 Bufalin可通過抑制mTOR/4E-BP1信號通路的活化來達到抑制腫瘤生長的效果，為Bufalin成為人食管鱗狀細胞癌的分子靶向治療藥物提供了一個重要的理論依據。
　　3 Bufalin作用后的凋亡促進基因Ba