siRNA抑制ZNF139對(duì)人胃癌裸鼠原位移植瘤細(xì)胞凋亡影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:胃癌是一種常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年大量研究表明，鋅指蛋白Krüppel家族中的許多成員可以通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，來(lái)介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)。ZNF139就屬于Krüppel家族成員。本課題組前期研究表明:ZNF139在大多數(shù)胃癌中高表達(dá)，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。而ZNF139基因的表達(dá)與胃癌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2的表達(dá)是否有關(guān)尚無(wú)報(bào)道，有待于通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)利用重組質(zhì)粒si

2、RNA-ZNF139沉默人胃癌細(xì)胞SGC-7901裸鼠原位移植瘤中ZNF139基因的表達(dá)，以觀察研究其對(duì)人胃癌裸鼠原位移植瘤細(xì)胞凋亡水平的影響，探討ZNF139與胃癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系及機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139及陰性對(duì)照質(zhì)粒control-siRNA由天根生化科技有限公司設(shè)計(jì)合成，應(yīng)用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取重組質(zhì)粒。抽提完畢后，所提取的質(zhì)粒經(jīng)紫外分光光度儀檢測(cè)濃度和純度。利用RT-

3、PCR方法檢測(cè)重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139的沉默效率。
　　 2.以人胃癌細(xì)胞株SGC-7901反復(fù)接種傳代于BALB/C-(nu/nu)裸小鼠皮下形成的皮下移植瘤組織塊為材料，將傳代6次的組織塊接種在裸小鼠胃壁漿膜層下，觀察裸鼠的生存狀態(tài)及移植瘤的生長(zhǎng)情況。建立人胃癌細(xì)胞株SGC-7901裸鼠原位移植瘤動(dòng)物模型。
　　 3.待腫瘤直徑約5mm時(shí)，將其隨機(jī)分為3組，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組5只。1天、3天

4、、5天、7天、9天，利用微量注射器分別將生理鹽水50μl，control-siRNA20μg，重組質(zhì)粒siRNA-ZNF13920μg注射入對(duì)應(yīng)組的裸鼠原位移植瘤內(nèi)。每天觀察原位移植瘤的生長(zhǎng)情況。
　　 4.在每次對(duì)瘤內(nèi)進(jìn)行注射前和處死裸鼠剝?nèi)≡灰浦擦龊鬁y(cè)量移植瘤的最長(zhǎng)徑(A)及最短徑(B)，根據(jù)公式:腫瘤體積(mm3)=1/2×A×B2，計(jì)算腫瘤的近似體積，并制作腫瘤的生長(zhǎng)曲線。
　　 5.對(duì)裸鼠干預(yù)5次后，于第11

5、天頸椎脫臼處死全部裸鼠，完整剝離瘤體，稱取瘤重，以計(jì)算腫瘤抑制率，腫瘤抑制率=（對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重）/對(duì)照組瘤重×100％。
　　 6.處死裸鼠，完整剝離瘤體后，取少量新鮮瘤體標(biāo)本，制作單細(xì)胞懸液，利用MTT法測(cè)定三組裸鼠胃癌細(xì)胞的存活率。
　　 7.通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組裸鼠胃癌細(xì)胞的凋亡率。
　　 8.利用RT-PCR方法測(cè)定三組裸鼠胃癌細(xì)胞中ZNF139、Bax、Bcl-2基因在mRNA水平的表達(dá)并進(jìn)行

6、比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.ZNF139基因沉默效率的檢測(cè)
　　 空白對(duì)照組ZNF139mRNA表達(dá)量(0.3586±0.0361)明顯高于實(shí)驗(yàn)組(0.1237±0.0131)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。陰性對(duì)照組ZNF139mRNA表達(dá)量(0.3601±0.0296)明顯高于實(shí)驗(yàn)組(0.1237±0.0131)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。沉默效率為65.7％。
　　 2.人胃癌細(xì)

7、胞株SGC-7901裸鼠原位移植瘤模型的建立成功建立人胃癌細(xì)胞株SGC-7901裸鼠原位移植瘤模型，成瘤率100％(15/15)。
　　 3.重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139對(duì)人胃癌裸鼠原位移植瘤體的影響
　　 3.1移植瘤的生長(zhǎng)情況
　　 空白對(duì)照組裸鼠腫瘤終體積(361.21±15.09)mm3明顯大于實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤終體積(153.14±5.78)mm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。陰性對(duì)照組裸鼠腫瘤

8、終體積(354.09±9.79)mm3明顯大于實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤終體積(153.14±5.78)mm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組之間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.32)。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積生長(zhǎng)速度明顯減慢(Fig.5)，而陰性對(duì)照組腫瘤體積的生長(zhǎng)速率略小于空白對(duì)照組。
　　 3.2重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139的抑瘤作用
　　 空白對(duì)照組裸鼠腫瘤的重量(2.41±0

9、.13)g明顯大于實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤的重量(1.11±0.06)g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。陰性對(duì)照組裸鼠腫瘤的重量(2.30±0.10)g明顯大于實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤的重量(1.11±0.06)g，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組之間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.11)。與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的抑瘤率為53.94％，而陰性對(duì)照組的抑瘤率僅為4.56％。
　　 4.重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139對(duì)人

10、胃癌裸鼠原位移植腫瘤細(xì)胞存活率的影響
　　 空白對(duì)照組裸鼠胃癌細(xì)胞的吸光度值(0.5014±0.0487)明顯高于實(shí)驗(yàn)組裸鼠胃癌細(xì)胞的吸光度值(0.2768±0.0048)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。陰性對(duì)照組裸鼠胃癌細(xì)胞的吸光度值(0.4926±0.0715)明顯高于實(shí)驗(yàn)組裸鼠胃癌細(xì)胞的吸光度值(0.2768±0.0048)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01）?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組之間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.9

11、7)。
　　 5.重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139對(duì)人胃癌裸鼠原位移植腫瘤細(xì)胞凋亡的影響
　　 空白對(duì)照組裸鼠胃癌細(xì)胞的凋亡率(18.3800±4.6855)％明顯低于實(shí)驗(yàn)組裸鼠胃癌細(xì)胞的凋亡率(33.3900±2.2393)％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00）。陰性對(duì)照組裸鼠胃癌細(xì)胞的凋亡率(16.9160±2.6913)％明顯低于實(shí)驗(yàn)組裸鼠胃癌細(xì)胞的凋亡率(33.3900±2.2393)％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=

12、0.00）。空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.51)。
　　 6.ZNF139、Bax、Bcl-2/mRNA在三組裸鼠胃癌組織中的表達(dá)情況
　　 6.1ZNF139mRNA的表達(dá)
　　 ZNF139在實(shí)驗(yàn)組裸鼠胃癌組織中的表達(dá)水平(0.1237±0.0131)明顯低于空白對(duì)照組(0.3586±0.0361)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。ZNF139在實(shí)驗(yàn)組裸鼠胃癌組織中的表達(dá)水平(0.

13、1237±0.0131)明顯低于陰性對(duì)照組(0.3601±0.0296)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.93）。
　　 6.2BaxmRNA的表達(dá)
　　 Bax在實(shí)驗(yàn)組裸鼠胃癌組織中的表達(dá)水平(0.4981±0.0704)明顯高于空白對(duì)照組(0.2036±0.0531)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00）。Bax在實(shí)驗(yàn)組裸鼠胃癌組織中的表達(dá)水平(0.4981±0

14、.0704)明顯高于陰性對(duì)照組(0.1981±0.0547)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）。空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.89）。
　　 6.3Bcl-2mRNA的表達(dá)
　　 Bcl-2在實(shí)驗(yàn)組裸鼠胃癌組織中的表達(dá)水平(0.0357±0.0039)明顯低于空白對(duì)照組(0.1379±0.0366)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。Bcl-2在實(shí)驗(yàn)組裸鼠胃癌組織中的表達(dá)水平(0.0357±0

15、.0039)明顯低于陰性對(duì)照組(0.1437±0.0379)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組之間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.77)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功建立人胃癌組織塊裸鼠原位移植瘤模型。
　　 2.應(yīng)用重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139抑制ZNF139基因可以顯著的抑制裸鼠原位移植瘤的生長(zhǎng)，使其生長(zhǎng)速度減慢，體積變小。
　　 3.重組質(zhì)粒siRNA-ZNF139可以降