iNOS信號(hào)通路對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌治療的重要作用.pdf

1、肺癌目前仍然是一個(gè)嚴(yán)重的公眾健康問題，并且占全世界癌癥死亡原因的第一位，其中所有階段的五年存活率非小細(xì)胞肺癌為14-17％，小細(xì)胞肺癌僅為6％。臨床和流行病學(xué)研究表明肺部的慢性感染，慢性炎癥與肺癌之間有著非常密切的關(guān)聯(lián)。在慢性感染和慢性炎癥中免疫系統(tǒng)在維持組織平衡，細(xì)胞代謝，組織重構(gòu)，以及防止感染和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等過程中起著至關(guān)重要的作用。在腫瘤發(fā)展過程中包括很多不同的炎性組分，這些組分可以釋放多種細(xì)胞因子，趨化因子及細(xì)胞毒性介質(zhì)，成為促進(jìn)炎

2、性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。如活性氧(ROS)，金屬蛋白酶，白細(xì)胞介素，和干擾素等。癌癥相關(guān)炎癥影響到惡性腫瘤的許多方面，其中包括增殖和惡性細(xì)胞的存活，腫瘤血管生成，惡性腫瘤轉(zhuǎn)移，以及腫瘤對(duì)化療藥物和激素的敏感性。
　　肺癌是目前最常診斷的腫瘤，居男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，女性癌癥相關(guān)死亡原因的第二位。無論在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，乳腺癌和肺癌分別是在女性和男性中最常見的惡行腫瘤和癌癥死亡的首要原因。觀察肺癌在不同國家的發(fā)生及變

3、化趨勢(shì)或者是每個(gè)國家的男女性之間發(fā)生比率可以看出與煙草的使用頻率有非常密切的關(guān)系。有學(xué)者統(tǒng)計(jì)，大約有20％的腫瘤與慢性感染有關(guān)，30％與吸煙及吸入污染物（例如二氧化硅和石棉）有關(guān)，35％與飲食因素有關(guān)（其中20％的腫瘤負(fù)荷與肥胖相關(guān)）。
　　現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合成酶(NOS)在腫瘤的發(fā)生過程中有著重要的意義。首先發(fā)現(xiàn)的第一種一氧化氮合成酶(NOS)是從大腦神經(jīng)組織中純化出來的，命名為神經(jīng)元型NOS或Ⅰ型NOS(nNOS或NO

4、S-1);隨后發(fā)現(xiàn)了誘導(dǎo)型NOS，稱為二型NOS(iNOS或NOS-2);后來又發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮型或Ⅲ型NOS(eNOS或NOS-3)。這三種不同類型的一氧化氮合成酶的基因分別位于三個(gè)不同的染色體。其中NOS2可以通過誘導(dǎo)產(chǎn)生，如脂多糖(LPS)或許多促炎細(xì)胞因子(IL-1，IFNγ，TNFa)，并在體內(nèi)迅速表達(dá)，產(chǎn)生大量的一氧化氮，并廣泛分布在不同類型的細(xì)胞中。過多的一氧化氮對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖有重要的意義，并且在許多病理狀態(tài)下也會(huì)促進(jìn)一氧化

5、氮的產(chǎn)生，例如(1)組織急性損傷和各種炎癥性疾病(2)神經(jīng)系統(tǒng)疾病(3)的自身免疫性疾病(4)血管生成及相關(guān)疾病(5)糖尿病。
　　iNOS最先在小鼠的巨噬細(xì)胞中被分離出來。巨噬細(xì)胞產(chǎn)生通過誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶可以產(chǎn)生一氧化氮及活性氧，繼而產(chǎn)生過氧陰離子對(duì)體內(nèi)的微生物起殺傷作用。但是過量的一氧化氮，活性氧和過氧陰離子可以增加機(jī)體的氧化應(yīng)激和組織損傷，可以造成機(jī)體慢性炎癥的病理狀態(tài)。在一些慢性炎癥性疾病中，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是誘發(fā)腫瘤的

6、危險(xiǎn)因素之一。
　　在肺自發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌的小鼠模型(Lori-IKKαK44A/K44A)中發(fā)現(xiàn)，IKKα激酶失活，IKKα水平下調(diào)對(duì)小鼠肺鱗癌的發(fā)生有重要的促進(jìn)作用，在研究中發(fā)現(xiàn)其肺部鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生率與肺部的腫瘤微環(huán)境有密切的關(guān)系，在腫瘤組織及近端癌旁組織中發(fā)現(xiàn)了iNOS及炎性細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)增高。這也與人類的發(fā)病狀況相似。同時(shí)該研究中通過剔除巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可以降低肺腫瘤組織中的炎性細(xì)胞因子明顯降低。為了進(jìn)一步觀察iNOS

7、在肺鱗狀細(xì)胞癌中的重要作用。我們?cè)谶@個(gè)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上通過基因雜交技術(shù)將小鼠的iNOS基因敲除(iNOS-/-)，觀察小鼠腫瘤的發(fā)生率影響及iNOS對(duì)腫瘤的治療作用。
　　研究目的:
　　通過iNOS基因敲除小鼠觀察iNOS信號(hào)通路在肺鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，探討iNOS在人肺鱗狀細(xì)胞癌中治療意義。
　　研究對(duì)象:
　　本研究中所有小鼠均按照美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)動(dòng)物管理與應(yīng)用委員會(huì)(IACUC

8、)制定的指南為原則，在相對(duì)無菌潔凈的動(dòng)物房中飼養(yǎng)。通過基因雜交技術(shù)以FVB小鼠為基礎(chǔ)雜交L-IKKαK44A/K44A小鼠與L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-小鼠。以第七代至第九代小鼠為觀察對(duì)象，分成WT、L-IKKαK44A/K44A、L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-三組，每組選取50只為觀察對(duì)象，其中18只持續(xù)每天觀察小鼠的活動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)食狀況，皮膚毛發(fā)的脫落情況，呼吸頻率及呼吸困難的程度，發(fā)現(xiàn)異常及時(shí)進(jìn)行無痛處

9、死，留取肺臟、脾臟組織。
　　研究方法:
　　1.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)篩選所需基因型的小鼠，包括Loricrin基因陽性，IKKαK44A/K44A及NOS2-/-基因突變純合子的小鼠。根據(jù)需要保留雜合子小鼠用于傳代。
　　2.熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)。用TRIzol溶液提取組織及細(xì)胞中的RNA，用Tetro cDNA Synthesis Kit(BIOLINE，USA)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后檢測(cè)三組小鼠肺

10、臟組織中IL4，IL5，IL10，IL17a的RNA水平，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。同時(shí)用Real-time PCR for RT2 Profiler PCR-array檢測(cè)三組小鼠肺臟及CD4+T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子及趨化因子的變化趨勢(shì)。
　　3.用流式細(xì)胞儀分離提取脾臟CD4+T細(xì)胞。每組選取6-8周齡小鼠3-5只，通過PE CD4，APC-Cy7 CD8，及7ADD標(biāo)記脾臟細(xì)胞，分離提取出CD4陽性的T淋巴細(xì)胞，提取RNA后檢測(cè)細(xì)胞因

11、子水平。
　　4.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠肺臟中的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)量。每組選取10-12周齡小鼠3-5只，孵育肺臟細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)記抗體: FITC CD45，PE CD11c, PE-Cy7 CD11b, APC F4/80,APC-Cy7 MHCⅡ,700 GR1。淋巴細(xì)胞標(biāo)記抗體:FITC CD45，PE CD4，PE-Cy78220，APC CD3，APC-Cy7CD8。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　5.用免疫雜交印記分析

12、(Western blot)的方法檢測(cè)小鼠肺臟組織中Trim29，環(huán)氧化酶-2(COX-2)的變化，每組小鼠選取5月齡，3只，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞中iNOS及Argeanse-1的變化，每組小鼠選取6-8周，3只，重復(fù)3次。
　　6.小鼠骨髓移植。選取6-8周齡的三組小鼠，每組5只，接受γ射線照射后進(jìn)行骨髓移植。供體為12周L-IKKαK44A/K44A，L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-兩組小鼠。移植前1周和

13、移植后2周受體小鼠接受含有抗生素的水喂食。接受移植后2個(gè)月處死小鼠觀察小鼠的肺部腫瘤發(fā)生率。
　　7.用8-0H-DG對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行免疫熒光染色。分別選取6月齡的小鼠的肺臟組織切片進(jìn)行免疫熒光染色，每組3只，觀察肺臟細(xì)胞中DNA損傷的變化。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入GraphPad Prism5制圖統(tǒng)計(jì)軟件，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用t-TEST進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

14、研究結(jié)果:
　　1.在持續(xù)觀察的18只小鼠中，F(xiàn)VB作為陰性對(duì)照均可健康成活一年。L-IKKαK44A/K44A組中的小鼠在六個(gè)月時(shí)有15只小鼠，肉眼均可見肺部腫瘤，病理學(xué)切片顯示均為肺鱗狀細(xì)胞癌，其余3只在7-10個(gè)月時(shí)陸續(xù)死亡，病理結(jié)果也均為肺鱗狀細(xì)胞癌。L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-組中在6個(gè)月時(shí)12只小鼠中有1只死亡，肉眼可見肺部腫瘤，病理結(jié)果為鱗癌，其余11只處死后，其中1例病理學(xué)結(jié)果顯示肺鱗癌，剩余6只持

15、續(xù)觀察，小鼠伴有部分皮膚炎癥的表型，但都可以存活至12個(gè)月，處死后肉眼及病理學(xué)切片均未發(fā)現(xiàn)肺部腫瘤。因此我們將WT、Lori-IKKαK44A/K44A、 Lori-IKKαK44A/K44ANOS2-/-三組進(jìn)行比較。通過三組小鼠組織病理學(xué)切片HE染色對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Lori-IKKα K44A/K44ANOS2-/-組較Lori-IKKαK44A/K44A組肺組織炎性浸潤明顯減少，用免疫組化和流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組小鼠肺內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果

16、顯示Lori-IKKα K44A/K44ANOS2-/-組較Lori-IKKαK44A/K44A組肺臟巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少，p＜0.001，有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.為了證實(shí)iNOS在骨髓中的作用，我們分別用L-IKKαK44A/K44A和L-IKKαK44A/K44ANOS2-/-小鼠的骨髓，移植到三組小鼠體內(nèi)，2個(gè)月后觀察小鼠腫瘤的發(fā)生情況。結(jié)果顯示無論是受體或供體，存在iNOS-/-的小鼠肺部腫瘤的發(fā)生率都較iNOS+/

17、+有明顯的降低，而且在巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)的更加明顯，說明iNOS不僅可以在組織上皮細(xì)胞中可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長，而且在巨噬細(xì)胞中對(duì)腫瘤生長抑制過程起著更加重要的作用。
　　3.免疫雜交印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組較陽性對(duì)照組小鼠肺臟Trim29和COX2的表達(dá)都有顯著的下降，說明在iNOS-/-小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平下降，可以減少細(xì)胞的DNA損傷，同時(shí)8-OH-DG的免疫熒光染色也進(jìn)一步證實(shí)了該項(xiàng)結(jié)果。
　　4.用Real-time

18、PCR的方法檢測(cè)小鼠肺臟及T淋巴細(xì)胞的炎癥性因子的變化，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組較陽性對(duì)照組IL5，IL17a均降低，p＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1)iNOS在肺鱗狀細(xì)胞癌及其周圍微環(huán)境中的表達(dá)明顯增高，同時(shí)iNOS可以趨化巨噬細(xì)胞向腫瘤及腫瘤周圍組織聚集，加重腫瘤炎癥環(huán)境的加重，從而促進(jìn)腫瘤的生長。
　　2)通過NOS2-/-小鼠觀察到，iNOS水平降低可以明顯的降低腫瘤的發(fā)生率、延長小鼠的生存期。