Genistein對裸鼠卵巢癌移植瘤的影響.pdf

1、目的:在婦科惡性腫瘤中死亡率最高的當(dāng)屬卵巢癌。因其發(fā)生發(fā)展具有隱匿性的特點(diǎn)，約70％的患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于晚期(FIGO分期ⅡB-Ⅳ期)，其五年生存率不到40％。腫瘤減滅術(shù)聯(lián)合術(shù)后化療成為卵巢癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方案。靜脈化療復(fù)發(fā)率較高，腹腔化療可以延長無瘤生存期并延長總生存率，但其毒副作用較大，其應(yīng)用受到限制，因此，尋找低毒有效抗癌制劑成為當(dāng)前卵巢癌治療研究的重要課題。
　　大豆中天然存在的黃酮類化合物主要有3種，即大豆甙類(daidzi

2、n)、染料木甙類（genistin）、黃豆甙類(glycitin)，其中又以染料木黃酮(genistein)含量最多，活性最強(qiáng)，其化學(xué)名為4，5，7-三羥基異黃酮。研究表明genistein具有多種生物學(xué)活性，如雌激素樣作用、抗雌激素樣作用、抗氧化和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等，近年來因其顯著的防癌抗癌效果而倍受關(guān)注。然而genistein水溶性差，口服吸收效率較低。在絕大多數(shù)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中通常利用二甲基亞砜(DMSO)進(jìn)行溶解，但是DMSO對細(xì)胞的

3、毒副作用不可忽視，不僅影響實(shí)驗(yàn)效果，而且也限制藥物的臨床應(yīng)用。羥丙基-β-環(huán)糊精是一種無毒、刺激性小、可以供靜脈注射的輔料。經(jīng)羥丙基-β-環(huán)糊精包合后的黃酮類化合物，增強(qiáng)了藥物的生物利用度，改善了溶解度及穩(wěn)定性。近年來研究發(fā)現(xiàn)microRNAs是腫瘤形成過程的重要參與者，人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與microRNAs的異常表達(dá)有關(guān)，扮演著癌基因與抑癌基因的角色。本課題以人卵巢上皮性癌裸鼠皮下移植瘤為研究對象，利用羥丙基-β-環(huán)糊精包合的ge

4、nistein，探討Genistein對人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的抑制作用及其對PTEN蛋白和microR-21的影響，為Genistein在上皮性卵巢癌的臨床治療及預(yù)防中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞，培養(yǎng)在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱為溫度為37℃，含5％CO2。
　　2.裸鼠移植瘤模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為BALB/C/nu/nu無

5、胸腺裸小鼠，5～6周齡，18-22g，雌性，在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)。常規(guī)無菌培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長至對數(shù)期時(shí)，用0.25％胰酶對細(xì)胞進(jìn)行消化，離心，配制成2.5×107個(gè)/ml單細(xì)胞懸液，在無菌條件下接種于裸鼠背部近前肢處的皮下，每只裸鼠接種0.2ml（即5×106個(gè)細(xì)胞）單細(xì)胞懸液。觀察移植瘤生長情況，種瘤第7天選出移植瘤接種成功，并且移植瘤直徑在4～7mm的的裸鼠進(jìn)行試驗(yàn)，將選出的裸鼠隨機(jī)分成六組:對照組（輔料組）順鉑組，Gen

6、istein包合物低劑量組，順鉑+Genistein包合物低劑量組，Genistein包合物中劑量組，Genistein包合物高劑量組，每組6只。
　　3.實(shí)驗(yàn)藥物的制備:Genistein包合物、輔料、順鉑均由0.9％氯化鈉注射液配制成所需濃度，即刻使用。
　　4.給藥方法:Genistein包合物含genistein的濃度為6％，用藥中低、中、高劑量分別按含genistein量50mg/kg、150mg/kg、450mg

7、/kg腹腔注射，每天一次，連續(xù)3周;對照組（輔料組）按Genistein包合物低劑量組所含羥丙基β-環(huán)糊精量進(jìn)行腹腔注射，每天一次，連續(xù)3周，順鉑組按3 mg/kg腹腔注射，每天一次，連用7天，3周后處死;Genistein包合物低劑量+順鉑組同兩藥單獨(dú)給藥方法。
　　5.裸鼠重量及移植瘤體積和重量的測量:從種瘤后開始每天觀察裸鼠精神狀態(tài)、飲食、大便、活動(dòng)及生長等情況。治療前測裸鼠體重，移植瘤的最長徑(a)和最短徑(b)，治療后，

8、每周測量裸鼠體重，移植瘤的最長徑(a)和最短徑(b)，并按公式V(mm3)=πab2/6計(jì)算移植瘤體積。停藥24小時(shí)終止觀察，脫頸法處死裸鼠，剝?nèi)×鼋M織，并稱重。計(jì)算腫瘤抑瘤率IR(％)=（1-治療組腫瘤平均瘤重/對照組中平均瘤重）×100％。
　　6.免疫組織化學(xué)染色檢測移植瘤組織中PTEN蛋白的表達(dá)情況。
　　7.用RT-qPCR技術(shù)檢測移植瘤組織中microR-21、PTEN mMRA的表達(dá)。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

9、:采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。等級資料按秩轉(zhuǎn)換多個(gè)獨(dú)立樣本比較的Student-Newman-kelus檢驗(yàn)，計(jì)量資料以析因設(shè)計(jì)和單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.給藥過程順利，順鉑組及聯(lián)合用藥組裸鼠出現(xiàn)消瘦、精神狀態(tài)較差，隨著周齡的增加，體重有下降趨勢，且與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其余各組裸鼠體重均有所增長，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在開始給

10、藥時(shí)，各組移植瘤體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨時(shí)間延長各組瘤體積均逐漸增大，給藥第22天各組移植瘤平均體積均比對照組小。處死裸鼠后各組抑瘤率分別為:聯(lián)合用藥組＞順鉑組＞ Genistein包合物低劑量組;genistein包合物高劑量組＞中劑量組＞低劑量組。順鉑和genistein包合物雖然都能抑制腫瘤生長，但是順鉑和genistein包合物并無明顯的協(xié)同作用。
　　2.裸鼠移植瘤組織中PTEN蛋白表達(dá)情況:各劑量genistein包合物均

11、能增加PTEN蛋白表達(dá)，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是順鉑組對PTEN蛋白表達(dá)則無明顯影響，聯(lián)合組統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示genistein包合物與順鉑對PTEN蛋白表達(dá)無協(xié)同作用;與PTEN蛋白相對應(yīng)的PTENmRNA結(jié)果也有上述規(guī)律。
　　3.裸鼠移植瘤組織中miR-21的表達(dá)情況:各劑量genistein包合物均能降低miR-21的表達(dá)，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是順鉑組對miR-21的表達(dá)則無明顯影響，聯(lián)合組統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示g

12、enistein包合物與順鉑對miR-21的表達(dá)無協(xié)同作用，說明順鉑不能降低miR-21的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.順鉑與Genistein包合物均具有抑制腫瘤生長的作用，并隨genistein劑量增大抑制作用也增強(qiáng)，聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥組均能增加對腫瘤生長的抑制，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異并無顯著性，可能與樣本量較小有關(guān)。
　　2.Genistein包合物可明顯增加PTEN蛋白的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，但順鉑對PTEN蛋白表達(dá)