TSP-1功能片段阻抑潛在TGF-β1活化及其抑制肺纖維化的實驗研究.pdf

1、肺纖維化是以大量的成纖維細(xì)胞聚集、細(xì)胞外基質(zhì)成分如膠原蛋白大量沉積而導(dǎo)致正常的肺組織結(jié)構(gòu)改變和功能喪失的一類疾病。肺纖維化疾病包括特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)、塵肺、藥物和放射線導(dǎo)致的纖維化等。 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵的作用。肺損傷后肺巨噬細(xì)胞受到刺激而被激活，分泌大量潛在非

2、活化形式的TGF-β1，稱之為潛在TGF-β1(latent-TGF-β1，L-TGF-β1)，這種L-TGF-β1是由潛在聯(lián)系多肽(Latency—associated peptide，LAP)和TGF-β1以1:1的比率非共價結(jié)合而成的蛋白復(fù)合物，該蛋白復(fù)合物不能與TGF-β1受體結(jié)合，因此不能發(fā)揮其生物學(xué)活性。 血小板反應(yīng)素—1(trombospondin—1，TSP—1)是L-TGF-β1活化過程中一個重要介質(zhì)。TSP—

3、1由3條相同肽鏈構(gòu)成的同源三聚體基質(zhì)糖蛋白，每條肽鏈由N端、C端球狀結(jié)構(gòu)域、原膠原同源區(qū)、type1重復(fù)序列、type2重復(fù)序列、type3重復(fù)序列組成。其中type1重復(fù)序列(thrombospondin typel repeats，TSRs)由3個備解素樣基序(TSR1、TSR2、TSR3)組成。目前已清楚，TSP—1分子KRFK序列可與L-TGF-β1分子的LAP相互作用，形成TSP—1/L-TGF-β1蛋白復(fù)合物。TSR2和TS

4、R3基序中的CSVTCG氨基酸結(jié)構(gòu)域與肺巨噬細(xì)胞膜上TSP—1受體CD36特異結(jié)合，再形成CD36/TSP—1/L-TGF-β1蛋白復(fù)合物，被激活的肺巨噬細(xì)胞同時還合成大量的纖溶酶，該蛋白復(fù)合物在纖溶酶的作用下發(fā)生空間構(gòu)象變化，使TGF-β1與LAP發(fā)生分離，從而產(chǎn)生活化的TGF-β1，繼而發(fā)揮致纖維化作用。 依據(jù)L-TGF-β1活化機(jī)制，TSP—1/L-TGF-β1蛋白復(fù)合物通過TSP—1與肺巨噬細(xì)胞膜上TSP—1受體CD36

5、特異結(jié)合，這個過程是L-TGF-β1活化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TSP—1主要依靠TSR2—3基序中以CSVTCG氨基酸肽段為主的結(jié)構(gòu)域與CD36特異結(jié)合。據(jù)此，該研究應(yīng)用含有CSVTCG氨基酸序列的TSP—1功能片段，利用其可以與肺巨噬細(xì)胞膜上CD36特異結(jié)合的特性，從源頭上阻抑活化的TGF-β1的產(chǎn)生，從而更有效地抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。本實驗對含有CSVTCG氨基酸結(jié)構(gòu)域TSP—1分子中TSR2—3進(jìn)行基因克隆、擴(kuò)增及目的蛋白的表達(dá)，并在體外

6、、體內(nèi)進(jìn)一步觀察TSP—1功能片段阻抑L-TGF-β1活化及其在肺纖維化動物模型體內(nèi)抑制肺纖維化發(fā)生發(fā)展的效果，這將為闡明肺纖維化的分子機(jī)制提供實驗依據(jù)。 材料與方法： 一、pGEX—5X-2-TSR2—3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 采用TRIZOL一步法提取小鼠肺組織中總mRNA，RT-PCR擴(kuò)增TSR2—3基因片段。pGEX—5X—2載體和目的基因片段經(jīng)EcolRⅠ、XolⅠ雙酶切后連接構(gòu)建pGEX—5X-2-TS

7、R2—3重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入宿主菌DH5α，菌液涂布于瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。隨機(jī)挑取單菌落，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA，雙酶切鑒定陽性菌落。 二、pGEX—5X-2-TSR2—3重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)、鑒定及純化 陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，應(yīng)用濃度為1.0 mmol幾的IPTG30℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3h。SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-Polyacrylanude gel electrophores

8、is，SDS-PAGE)分析表達(dá)產(chǎn)物，考馬斯亮藍(lán)染色。免疫印跡鑒定(Western blot)鑒定表達(dá)產(chǎn)物，谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶(GST)抗體反應(yīng)過夜，ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色。GSTrapFF柱親和層析純化目的重組蛋白。 三、細(xì)胞免疫熒光方法檢測TSR2—3 GST融合蛋白活性及TSP—1功能片段對L-TGF-β1活化的抑制作用 大鼠肺內(nèi)注入博來霉素第7天，行氣管肺泡灌洗，收集灌洗液，獲得肺巨噬細(xì)胞。①加入TSR2—3

9、GST融合蛋白及GST蛋白，GST、CD36一抗反應(yīng)過夜，F(xiàn)ITC、TRITC熒光標(biāo)記的二抗定位，加核熒光染料TOP3染核。②加入TSR2—3 GST融合蛋白、GST蛋白、TSP—1功能肽段、對照肽段和CD36抗體，TGF-β1、CD36一抗反應(yīng)過夜，F(xiàn)ITC、TRITC熒光標(biāo)記的二抗定位，加核熒光染料Hoechst染核。熒光顯微鏡下觀察。 四、酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)方法檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1含量

10、 未經(jīng)過HC1酸化的為活化TGF-β1量，經(jīng)過HC1酸化的為總TGF-β1量。捕獲抗體包板，4℃培養(yǎng)過夜。加封閉液，室溫培養(yǎng)1h。加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，室溫培養(yǎng)2h，加檢測抗體室溫培養(yǎng)2h。加辣根過氧化物酶封板，避光室溫培養(yǎng)20min。加底物，避光室溫培養(yǎng)20min。加終止液，用酶標(biāo)儀在450nm處測量光密度值。 五、肺組織羥脯氨酸含量測定 堿水解方法測定肺組織羥脯氨酸含量，含量以μg/mg肺組織表示。 六、肺組

11、織學(xué)觀察 常規(guī)石蠟切片(5μm)，經(jīng)脫蠟脫水后HE、vG染色，觀察肺組織病理學(xué)改變。 七、免疫組織化學(xué)方法觀察肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá) 采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒(SP)對肺組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原進(jìn)行染色。切片常規(guī)脫蠟至水，血清封閉，孵育30min；滴加稀釋的Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體，4℃過夜；PBS洗滌，滴加二抗，孵育30min；PBS洗滌，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，孵育30min；PBS洗滌，滴

12、加3，3—二氨基聯(lián)苯胺(DAB)室溫顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。結(jié)果判斷：免疫組化結(jié)果以細(xì)胞漿或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色，并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。在10×40倍視野下，在每個切片隨機(jī)選取5個視野。用陽性細(xì)胞平均積分光密度代表Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)量。 八、統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，統(tǒng)計結(jié)果表示為x±s，差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，用SNK法進(jìn)行組間比較，P<0.05

13、具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1、成功克隆小鼠TSR2—3基因片段，并在E.coli BL21中高效表達(dá)，親和層析后獲得高純度TSR2—3 GST融合蛋白。 2、TSP—1功能片段可通過與巨噬細(xì)胞膜上的CD36特異結(jié)合阻抑內(nèi)源性TSP—1/L-TGF-β1蛋白復(fù)合物與CD36結(jié)合進(jìn)而抑制了L-TGF-β1的活化。 3、CSVTCG/TSP—1功能肽段可降低由博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型的肺組織羥脯氨酸含量和Ⅰ