腺病毒載體介導(dǎo)的RNAi抑制肺間質(zhì)纖維化大鼠TGF-β1基因表達(dá)的研究.pdf

1、背景
　　 纖維化可導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退、乃至衰竭。肺間質(zhì)纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是由多種因素引起的一組肺間質(zhì)彌漫性疾病，是異質(zhì)性疾病，也是多種肺疾病的共同結(jié)局，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究證實(shí)肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的高表達(dá)密切相關(guān)。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是公認(rèn)的肺間質(zhì)纖維化形成和發(fā)展中的“開關(guān)性”細(xì)胞因子，作為一種多功能及強(qiáng)效的致纖維化

2、因子，參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular membrane)分泌，增加ECM的聚積并抑制其降解，在肺纖維化形成過程中主要作用于膠原的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，誘導(dǎo)前膠原mRNA的產(chǎn)生，促進(jìn)膠原蛋白的形成和沉積，是纖維化發(fā)生過程中最直接的一種細(xì)胞因子。抑制TGF-β1基因表達(dá)顯然有助于延緩肺纖維化進(jìn)程，而應(yīng)用常規(guī)抗纖維化藥物抑制其表達(dá)的效果并不理想。
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi

3、)是新近出現(xiàn)的一種分子生物學(xué)技術(shù)，它通過導(dǎo)入由對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)，誘導(dǎo)受體細(xì)胞中與其有同源序列的特異性靶mRNA降解，阻止蛋白質(zhì)的翻譯過程，其作用類似于基因敲除，但基因表達(dá)并未永遠(yuǎn)消除，因而又被稱為“基因沉默”。
　　 目的
　　 本研究針對(duì)大鼠TGF-β1的mRNA序列設(shè)計(jì)、合成并構(gòu)建具有特異性阻斷大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)基因的TG

4、F-β1siRNA Shuttle載體，然后重組入腺病毒載體，包裝成轉(zhuǎn)化生長因子受體β1(TGF-β1)siRNA的腺病毒，將腺病毒載體局部轉(zhuǎn)染肺間質(zhì)纖維化大鼠，觀察并分析其對(duì)TGF-β1mRNA表達(dá)的抑制作用，為肺纖維化的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 60只SD雄性大鼠，生理鹽水對(duì)照組、重組復(fù)制缺陷型TGF-β1腺病毒治療組、空載體對(duì)照組，第0d經(jīng)氣管滴入0.3ml的博來霉素(BLM3mg/kg)建立肺

5、間質(zhì)纖維化模型，空白對(duì)照組大鼠滴注等體積生理鹽水，治療組于滴入博來霉素24h后經(jīng)鼻滴入重組復(fù)制缺陷型TGF-β1腺病毒(AdCMV TGF-β1)10×109空斑形成單位(pfu)(100μl/鼠)，生理鹽水組于造模后24h經(jīng)鼻滴入同體積的生理鹽水，同時(shí)設(shè)立無外源活性基因的復(fù)制缺陷型腺病毒(AdCMVNull)空載體對(duì)照組，空白對(duì)照組于24h給予氣管內(nèi)滴入同體積生理鹽水。各組動(dòng)物于7、14、28d隨機(jī)處死5只，取肺組織肺行蘇木精伊紅(H

6、E)染色；免疫組化法檢測(cè)肺組織TGF-β1的蛋白表達(dá)水平；熒光定量PCR檢測(cè)肺組織中TGF-β mRNA的表達(dá)水平；ELISA法檢測(cè)血清中TGF-B的蛋白的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)其對(duì)全身的影響。
　　 結(jié)果：
　　 HE染色示治療組各時(shí)期肺泡炎和肺纖維化程度均較生理鹽水對(duì)照組及空載體對(duì)照組輕；免疫組化結(jié)果顯示治療組與生理鹽水及空載體對(duì)照組相比肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR