POAG的線粒體發(fā)病機理研究.pdf

1、中山大學博士學位論文POAG的線粒體發(fā)病機理研究姓名：何媛申請學位級別：博士專業(yè)：眼科學指導教師：葛堅20090525中山大學博士學位論文POAG的線粒體發(fā)病機理研究本研究以原代POAG患者小梁網(wǎng)細胞(GTM)為研究對象，原代正常人小梁網(wǎng)細胞(NTM)為對照，采用激光共聚焦顯微鏡、流式細胞技術(shù)觀察細胞內(nèi)ROS水平，隨后分別經(jīng)過線粒體呼吸鏈復合物I、II、III抑制劑魚藤酮(Rotenone，ROT)、TTFA、AM、MYX，抗氧化劑Vi

2、tE、NAC處理后檢測細胞內(nèi)ROS的改變以及不同濃度ROT對小梁網(wǎng)細胞ROS產(chǎn)生的影響；采用流式細胞技術(shù)、MTT檢測ROT對小梁網(wǎng)細胞的生長抑制作用及其對細胞生長周期的影響；應(yīng)用生物化學發(fā)光技術(shù)檢測細胞內(nèi)ATP產(chǎn)量；紫外分光光度計檢測線粒體呼吸鏈復合物活性；活細胞及激光共聚焦顯微鏡下觀察各加藥組細胞的形態(tài)；通過AnnexinVFITC／PI雙標記及流式細胞技術(shù)檢測細胞的凋亡率；LDH試劑盒檢測細胞損傷；用JC1標記細胞線粒體膜電位(△l

3、壬，m)，并分別通過流式細胞儀和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測ROT以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孑L(MPTP)抑制劑CsAArA對小梁網(wǎng)細胞△甲m影響的差異。使用流式細胞技術(shù)檢測了CytC的釋放，進一步證實了ROT誘導GTM細胞凋亡的線粒體通路。為進一步觀察GTM細胞MPTP開放的機制，采用ROT誘導，激光共聚焦顯微鏡以及流式細胞儀觀察ROT對細胞內(nèi)鈣離子分布的影響，觀察鈣離子在GTM細胞MPTP開放中的作用，分析研究了通過ROT誘導GTM細胞MP

4、TP開放、CytC釋放和鈣離子誘導的線粒體鈣釋放(mCICR)之間的關(guān)系；為了進一步研究ROT誘導GTM內(nèi)升高的鈣離子足來源于細胞外還是細胞內(nèi)，應(yīng)用流式細胞儀觀察IP3R抑制劑2APB和XeC、L型鈣通道抑制劑nifedipine處理后細胞內(nèi)鈣信號的變化。實驗結(jié)果一、POAG患者小梁網(wǎng)細胞線粒體ComlexI活性下降引起ROS產(chǎn)生增多1小梁網(wǎng)細胞鑒定：原代正常人和POAG患者小梁網(wǎng)細胞均表達FN、LN、NSE、vimentin；第VII