乙型肝炎病毒對恩替卡韋耐藥的檢測和初步耐藥規(guī)律研究.pdf

1、背景： 慢性乙型肝炎(CHB)威脅全人類健康，其中1/3以上的慢性感染者在中國?？共《局委熓锹砸倚透窝椎暮诵闹委煷胧：塑疹愃莆锸悄壳翱共《局委煹闹髁魉幬镏?。恩替卡韋(ETV)作為強(qiáng)效抑制乙型肝炎病毒(HBV)的核苷類藥物已逐漸在臨床上得到應(yīng)用。隨著應(yīng)用時(shí)間的推移和應(yīng)用群體的擴(kuò)大，ETV耐藥問題逐漸出現(xiàn)。目前有關(guān)ETV耐藥的研究國內(nèi)外僅見個(gè)案報(bào)道，所以對我國ETV治療失敗的患者進(jìn)行耐藥檢測，對其基因變異特點(diǎn)與臨床特點(diǎn)進(jìn)行初步

2、分析，可以為ETV耐藥后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床應(yīng)用提供線索和依據(jù)。目前研究發(fā)現(xiàn)，ETV的耐藥至少涉及逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(RT區(qū))3個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合變異，且變異類型多樣，還可能存在尚未發(fā)現(xiàn)的變異，所以實(shí)時(shí)(Real—Time)熒光PCR、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)及基因芯片等檢測方法在建立上均比較困難，而PCR結(jié)合測序法則表現(xiàn)出很大的優(yōu)勢，具有更好的全面性。 目的： 1．建立一種可以較好擴(kuò)增HBV RT區(qū)的巢式PCR(ntPCR)

3、方法，結(jié)合直接測序和克隆測序法檢測HBV耐藥變異。 2．對我國ETV治療失敗的患者進(jìn)行初步的耐藥基因變異特點(diǎn)與臨床資料分析，為ETV耐藥后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床應(yīng)用提供線索和依據(jù)。 方法： 1．設(shè)計(jì)適于擴(kuò)增HBV RT區(qū)較長基因片段的ntPCR引物并檢驗(yàn)其效能。建立ntPCR—測序法耐藥檢測平臺，包括PCR產(chǎn)物直接測序和PCR克隆測序法。 2．篩集2008年1月～12月于北京地壇醫(yī)院就診的CHB患者中E

4、TV治療失敗的患者血清20例。入選標(biāo)準(zhǔn)：符合2000年《病毒性肝炎防治方案》CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者規(guī)范服用ETV(劑量：核苷初治0.5mg/d，既往LVD治療失敗患者1.0mg/d)并且出現(xiàn)治療失敗，除外依從性等原因。PCR產(chǎn)物直接測序法檢測20例標(biāo)本的耐藥情況，并分析其基因型。對其中的3例標(biāo)本進(jìn)行克隆測序，初步分析其耐藥基因特點(diǎn)。20例患者依據(jù)病毒學(xué)應(yīng)答情況，分為非完全病毒學(xué)應(yīng)答組(6例)和病毒學(xué)突破組(14例)，對這兩組及不同基因型(

5、B和C)的耐藥檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果: 1．瓊脂糖凝膠電泳和測序法證實(shí)，ntPCR可擴(kuò)增幾乎整個(gè)HBV RT區(qū)(nt146-1051)的位點(diǎn)，即rt5～rt318，包含有目前已知的所有變異位點(diǎn)，并且擴(kuò)增序列涵蓋了全長HBsAg編碼區(qū)，可同時(shí)用于對HBV S基因變異的檢測，還可以用于基因分型。擴(kuò)增目的產(chǎn)物經(jīng)直接測序確證無誤。 2．ETV治療失敗患者耐藥檢測結(jié)果： 2.1、 PCR直接測序法結(jié)果：

6、 (1)20例患者中檢出ETV耐藥11例，其RT區(qū)變異類型以rtM204V+rtL180M+rtT184L變異最多(8/11)，其次是rtM204V+rtL180M+rtS202G(3/11)，未發(fā)現(xiàn)rt250位點(diǎn)的變異。 (2)擴(kuò)增產(chǎn)物涵蓋HBV DNA全長HBsAg編碼序列，對其進(jìn)行分析，20例患者中檢出sP127T2例，sP127T為已發(fā)現(xiàn)的與HBsAg免疫逃逸有關(guān)的變異。 2.2、對3例標(biāo)本(1號、5號

7、和9號)進(jìn)行了克隆測序。結(jié)果提示同一模板重復(fù)PCR產(chǎn)物直接測序法檢測在一定程度上可彌補(bǔ)其敏感度低的缺陷。 2.3、所有ETV耐藥患者均來自病毒學(xué)突破組，非完全病毒學(xué)應(yīng)答組患者中未檢出ETV耐藥，二者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0022)。 2.4、在11例ETV耐藥患者中有10例既往有LVD治療失敗史，其從應(yīng)用ETV到出現(xiàn)耐藥變異的平均治療時(shí)間為(19.43±2.72)月。 2.5、在6例B基因型患者中檢出ETV耐

8、藥3例(3/6)，14例C基因型患者中檢出ETV耐藥8例(8/14)，二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論: 1．建立了一種較好擴(kuò)增HBV RT區(qū)較長片段的方法，并涵蓋全長HBsAg編碼區(qū)。該法結(jié)合測序法可以用于HBV P基因RT區(qū)及S基因變異的檢測，還可以用于基因分型。 2．我國B和C基因型的乙肝患者中，ETV耐藥類型以rtM204V+rtL180M+rtT184L多見。 3．ETV耐藥主要見于病毒學(xué)突破組，