乙型肝炎病毒耐藥新位點的研究.pdf

1、目的：建立并應用體外表型分析技術對乙型肝炎病毒（HBV）可能的耐藥新位點進行研究。本文主要分為兩個部分，第一部分分析核苷（酸）類藥物治療慢性乙型肝炎過程中出現(xiàn)的HBV耐藥變異模式及其特點，并從中得到可能的耐藥變異新位點。第二部分則是對所發(fā)現(xiàn)的新位點進行體外表型分析。 材料與方法：第一部分對2005年9月到2007年6月送檢的227份慢性乙型肝炎患者血清標本，應用Trugene試劑盒抽提、擴增HBV基因組聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)，

2、PCR產(chǎn)物經(jīng)過CLIP反應后加到MicroCel 500電泳膠板中電泳，應用GeneObjects軟件獲得樣本的序列，分析其突變，并應用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析。第二部分在上述研究結(jié)果的基礎上，選擇出現(xiàn)頻率最高的未知變異，利用定點突變技術構建帶有特定點突變的HBV重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染肝細胞系后并進行體外表型測定。 結(jié)果：在227份標本中有111份（49.0％）發(fā)現(xiàn)已知耐藥位點（rtM204V/I，rtL180M，rtV17

3、3L，rtV207I，rtN236T，rtA181V/T等）變異，其中明確用藥史的共75例。在拉米夫定和阿德福韋序貫治療的患者中出現(xiàn)多重耐藥變異的概率較高，為25.0％（4/16），而在先用拉米夫定后聯(lián)合阿德福韋治療的16例患者中未發(fā)現(xiàn)后續(xù)阿德福韋耐藥變異。在其他位點的變異中，以rtS256C、rtA222T和rtL229V出現(xiàn)頻率較高。通過初步建立的HBV體外表型分析系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，拉米夫定對單獨含有rtS256C突變的重組質(zhì)粒的IC5

4、0值為0.71±0.49umol/l，較野生株質(zhì)粒增高約4.44倍，當它伴隨其他變異出現(xiàn)時，HBV對拉米夫定的敏感性增減不一。阿德福韋酯對帶有rtI233V突變的重組質(zhì)粒的IC50值為1.69±0.52umol/l，較野生株升高6.50倍。 結(jié)論：在核苷（酸）類藥物治療慢性乙型肝炎過程中，出現(xiàn)的變異模式復雜，對已使用拉米夫定的患者，換用阿德福韋酯可導致多重耐藥變異。rtS256C變異在某些情況下能輕度降低HBV對LMV的敏感性，