建立瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型檢測(cè)乙型肝炎病毒表型耐藥.pdf

1、目的：
　　1、建立一種基于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的HBV表型耐藥檢測(cè)方法，并評(píng)價(jià)該方法的應(yīng)用價(jià)值。
　　2、使用表型耐藥檢測(cè)技術(shù)對(duì)體外準(zhǔn)種群進(jìn)行耐藥分析，探討突變株比例不同的HBV準(zhǔn)種群的耐藥規(guī)律性。
　　方法：
　　1、建立基于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的HBV表型耐藥檢測(cè)方法
　　在入選CHB患者標(biāo)本中篩選出含HBV野生株及突變株的血清標(biāo)本各1例，并從中分離HBV DNA，使用全基因擴(kuò)增技術(shù)在體外大量擴(kuò)增HBV全基因

2、組。利用BspQ I酶對(duì)真核表達(dá)載體pHY106以及包含HBV全基因組的pEASY-Blunt T載體進(jìn)行酶切消化，并經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化等步驟從單克隆菌落中篩選出正確連接HBV全基因組的轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pHY-CL與pHY-ZJ。大量提取重組質(zhì)粒載體，并將上述兩組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)后檢測(cè)培養(yǎng)體系上清液中HBV DNA，以驗(yàn)證瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的成功構(gòu)建。以相同的轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)染兩組質(zhì)粒并在轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)體系中，添

3、加拉米夫定溶液使體系終濃度分別達(dá)到0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，測(cè)定在各種藥物濃度下HBV DNA水平的改變并計(jì)算出IC50，以評(píng)價(jià)HBV野生株與突變株的藥物敏感性。
　　2、HBV準(zhǔn)種群的表型耐藥檢測(cè)與耐藥規(guī)律性分析
　　使用定點(diǎn)突變方法誘導(dǎo)野生型重組質(zhì)粒產(chǎn)生rtM204V點(diǎn)突變，將野生型質(zhì)粒和經(jīng)點(diǎn)突變的rtM204V突變型質(zhì)?；旌希蛔冃唾|(zhì)粒所占比例設(shè)定為0％、20%、40%、60%、8

4、0%、100%，以完成構(gòu)成體外逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)準(zhǔn)種群。不同比例組成的準(zhǔn)種群分別轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，檢測(cè)在各種藥物濃度下HBV DNA水平的改變，并計(jì)算出各準(zhǔn)種群的IC50。探討不同比例組成的HBV準(zhǔn)種群在體外表型耐藥的變化規(guī)律，評(píng)價(jià)表型耐藥檢測(cè)技術(shù)在HBV準(zhǔn)種群耐藥檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立了基于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的HBV表型耐藥檢測(cè)方法
　　在體外大量擴(kuò)增HBV全基因組，并與真核表達(dá)載體pHY10

5、6相連接。結(jié)果表明成功構(gòu)建了包含HBV野生株和突變株基因組的重組載體，且基因組序列與插入方向準(zhǔn)確無(wú)誤。將上述2種重組載體轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞后在培養(yǎng)體系上清液中可檢出高拷貝的HBV DNA，證實(shí)了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的成功構(gòu)建。再次將野生型及突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，在培養(yǎng)體系中添加不同濃度的LMV使得終濃度達(dá)到0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，檢測(cè)相應(yīng)藥物濃度下HBV DNA水平，并計(jì)算IC50，結(jié)果

6、顯示野生型和突變型質(zhì)粒的IC50分別為0.024μM與1.75μM，突變型質(zhì)粒的IC50較野生型增加了73倍，在體外達(dá)到耐藥水平。
　　2、HBV準(zhǔn)種群的表型耐藥檢測(cè)
　　成功使用定點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)野生型重組質(zhì)粒進(jìn)行rtM204V點(diǎn)突變改造，結(jié)果能保證非RT區(qū)以外的剩余HBV基因組序列不發(fā)生任何改變。將突變型質(zhì)粒比例為0%、20%、40%、60%、80%、100%的體外準(zhǔn)種群轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，IC50測(cè)定表明隨著突變株在

7、準(zhǔn)種群內(nèi)所占比例增大，IC50值亦顯著增加，其中尤其以突變株占20%~40%的比例區(qū)間增加最為顯著，該區(qū)間的細(xì)化分組試驗(yàn)亦能驗(yàn)證了這一結(jié)論，并提示HBV耐藥性可在突變型比例達(dá)到25%~30%時(shí)形成。上述研究結(jié)果均揭示了HBV準(zhǔn)種群中的野生株和突變株的比例組成與耐藥發(fā)生相關(guān)，突變株比例增高可引發(fā)耐藥，且準(zhǔn)種群形成耐藥的比例區(qū)間處于25%~30%的比例區(qū)間之內(nèi)。
　　結(jié)論：
　　1、成功建立瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型介導(dǎo)的表型耐藥檢測(cè)方法