基于顏色判定的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)銅綠假單胞菌及其OprD2耐藥基因的研究.pdf

1、目的
　　銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PAE)為條件致病菌,分布廣泛,在正常情況下不致病。但當(dāng)人體免疫力降低時(shí)(如:長(zhǎng)期應(yīng)用激素、腫瘤化療、AIDS)或嚴(yán)重創(chuàng)傷(如大面積燒傷、大型手術(shù))或醫(yī)療操作(如氣管切開(kāi)、插管)后,PAE引起的感染性疾病不斷增加。隨著抗生素的廣泛使用,耐藥銅綠假單胞菌的發(fā)生率增多,特別是多重耐藥菌,使臨床上治療該病原菌引起的相關(guān)感染變得越來(lái)越來(lái)困難。然而傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢查方法時(shí)間長(zhǎng)

2、、敏感性低,一直不能滿足臨床診治的需求。因此建立了一種新的、簡(jiǎn)單、快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法,對(duì)銅綠假單胞菌及耐藥性的早期診斷和治療具有重大意義。
　　本研究目的:了解臨床標(biāo)本中分離的銅綠假單胞菌對(duì)16種抗菌藥物的耐藥情況,為臨床合理使用抗生素提供參考。對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行相關(guān)耐藥基因的研究。建立一種基于顏色判定的,能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)銅綠假單胞菌及其OprD2耐藥基因的LAMP方法。
　　方法
　　對(duì)臨床收集47株耐藥銅

3、綠假單胞菌采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定對(duì)慶大霉素等16種抗菌藥物的敏感性。PCR擴(kuò)增檢測(cè)收集的銅綠假單胞菌標(biāo)本中的耐亞胺培南類IMP、VIM、GES、GIM、OXA-10、OprD2耐藥基因。針對(duì)銅綠假單胞菌OprL、OprD2基因設(shè)計(jì)LAMP引物,通過(guò)引物特異性識(shí)別OprL、OprD2的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域來(lái)快速檢測(cè)銅綠假單胞菌特有OprL基因和OprD2耐藥基因。如果在反應(yīng)前添加熒光染料羥基萘酚藍(lán)(HNB)或鈣黃綠素(Calcein),其結(jié)果可

4、以通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)前后顏色變化來(lái)判定并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。對(duì)該技術(shù)進(jìn)行特異性、靈敏度分析,用LAMP擴(kuò)增法、PCR擴(kuò)增法和臨床傳統(tǒng)方法同時(shí)檢測(cè)臨床標(biāo)本。
　　結(jié)果
　　1.47株耐藥PAE對(duì)頭孢噻肟耐藥率最高占97.87％,左旋氧氟沙星耐藥率占40.42%,氨曲南耐藥率占38.30%,哌拉西林耐藥率34.04%,美羅培南耐藥率占29.79%,亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮的耐藥率占27.66%。
　　2.47株P(guān)AE中

5、VIM基因陽(yáng)性12株,陽(yáng)性率25.53%,OXA-10基因陽(yáng)性2株,陽(yáng)性率4.26%,OprD2基因缺失23株,缺失率占48.94%,而IMP、GIM、GES基因均陰性。OprD2基因缺失株的頭孢噻肟、左氧氟沙星、氨曲南、哌拉西林、亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為100%(23/23)、56.52%(13/23)、47.83%(11/23)、47.83%(11/23)、47.83%(11/23)和43.48%(10/23)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果

6、顯示:與OprD2基因陽(yáng)性株相比,OprD2基因缺失株的亞胺培南、左旋氧氟沙星、美洛培南耐藥比例明顯升高(卡方值為9.155、4.846、4.037,P值為0.002、0.028、0.045,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。
　　3.設(shè)計(jì)出針對(duì)銅綠假單胞菌OprL基因、OprD2耐藥基因可直接肉眼判讀結(jié)果的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。本等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法只擴(kuò)增銅綠假單胞菌,對(duì)其他菌不擴(kuò)增,顯示出良好的特異性。其最低檢測(cè)限為17.414pg/μl,PCR方法

7、最低檢出限為174.414pg/μl,LAMP方法檢測(cè)靈敏度是PCR方法檢測(cè)靈敏度的10倍,靈敏度高。LAMP法與PCR法對(duì)臨床銅綠假單胞菌OprL基因和OprD2耐藥基因檢出率相當(dāng)。
　　結(jié)論
　　1.臨床銅綠假單胞菌耐藥情況嚴(yán)重,耐藥銅綠假單胞菌OprD2基因缺失較為普遍,47株中缺失23株占(48.94%)。OprD2基因缺失導(dǎo)致銅綠假單胞菌以亞胺培南為主的耐藥,因此明確OprD2基因分布狀況有助于臨床抗菌藥物的選用。