銅綠假單胞菌ampG基因的結(jié)構(gòu)及其對耐藥的影響.pdf

1、背景:
　　銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種臨床常見機(jī)會致病菌，常引起免疫力低下患者慢性感染。β-內(nèi)酰胺類抗生素是其臨床常用的治療藥物。但由于長期以來抗生素的濫用和不合理使用，導(dǎo)致致病菌的耐藥性越來越嚴(yán)重。β-內(nèi)酰胺類抗生素抗菌譜內(nèi)的多數(shù)細(xì)菌，包括銅綠假單胞菌，對β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗性有80％是由細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶所致。對于細(xì)菌研究較多的β-內(nèi)酰胺酶是AmpC產(chǎn)酶系統(tǒng)，尤其是其調(diào)節(jié)基因amp

2、R，ampD的突變對產(chǎn)酶系統(tǒng)的影響，而對另一種重要的調(diào)節(jié)基因ampG則研究較少。ampG存在于大多數(shù)革蘭陰性細(xì)菌，其編碼產(chǎn)物為AmpG蛋白。AmpG蛋白作為膜通道蛋白參與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的循環(huán)，當(dāng)有β-內(nèi)酰胺類抗生素存在于周圍環(huán)境時，它就具有重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，在細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶的過程中起到重要作用。將銅綠假單胞菌PAO1的ampG基因敲除后，可以阻斷其β-內(nèi)酰胺酶的誘導(dǎo)性，從而提高細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。質(zhì)子

3、勢能抑制劑羰基氰氯苯腙(CCCP)也可以通過阻斷AmpG的能量來源而抑制其活性，從而提高PAO1對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。
　　目的:
　　本文在現(xiàn)有對ampG基因研究的基礎(chǔ)上，先以NCBI數(shù)據(jù)庫中PAO1的ampG基因為參考序列，結(jié)合本研究從收集到的211株不同氨芐西林抗性的銅綠假單胞菌內(nèi)根據(jù)設(shè)定條件選取的60株ampG基因的測序結(jié)果，分析該基因在不同氨芐西林抗性的銅綠假單胞菌中的多態(tài)性;以敲除ampG基因后的銅綠假單

4、胞菌為受體，進(jìn)行遺傳互補(bǔ)實驗，探討不同氨芐西林抗性的ampG基因?qū)μ请牡霓D(zhuǎn)運(yùn)效率的影響，研究野生型銅綠假單胞菌中ampG基因的結(jié)構(gòu)對耐藥的影響;對PAO1的ampG基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，研究AmpG的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系;鑒于CCCP對AmpG的抑制作用，我們收集了數(shù)種外排泵抑制劑及其臨床來源的類似藥物90種，檢測它們與氨芐西林聯(lián)合使用對PAO1的抑菌效果，探索是否有與CCCP功能相似的藥物;之后將一株表現(xiàn)為多重耐藥的銅綠假單胞菌PA1280的a

5、mpG基因進(jìn)行敲除及回補(bǔ)，進(jìn)一步研究ampG基因?qū)σ吧豌~綠假單胞菌耐藥的影響，探索銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制，并為篩選和合成抑制AmpG功能的藥物奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、收集溫州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年至2013年從臨床標(biāo)本分離到的銅綠假單胞菌211株，并對其進(jìn)行氨芐西林藥敏測定。根據(jù)藥敏結(jié)果人為分為氨芐西林低抗(MIC≤512μg/ml)、中抗(512μg/ml＜MIC＜4096μg/ml)和高抗(MIC≥

6、4096μg/ml)三個梯度;
　　2、分別從三個梯度中各挑取20株提取基因組，并用ampG基因全長引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并克隆，將克隆送測驗證;以NCBI數(shù)據(jù)庫搜索到的銅綠假單胞菌PAO1的ampG序列為參考序列，用BioEdit軟件將測序成功的序列進(jìn)行比對;
　　3、以敲除ampG基因的銅綠假單胞菌PAO1△G為受體菌，進(jìn)行克隆ampG基因的回補(bǔ)實驗;
　　4、測定回補(bǔ)菌株的氨芐西林抗性水平，分析具有SNP位點(diǎn)的amp

7、G基因的轉(zhuǎn)運(yùn)糖肽的效率，進(jìn)行銅綠假單胞菌ampG基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究;
　　5、將PAO1的ampG基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，研究銅綠假單胞菌中該基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系:
　　6、檢測CCCP與部分抗生素聯(lián)用對25株臨床分離銅綠假單胞菌的抑菌效果，研究CCCP對野生型銅綠假單胞菌的作用;
　　7、檢測90種臨床來源藥物與氨芐西林聯(lián)合使用后對PAO1的抑菌效果;
　　8、用同源重組法將表現(xiàn)為多重耐藥的野生型銅綠假單胞

8、菌PA1280的ampG基因進(jìn)行敲除，構(gòu)建敲除株P(guān)A1280△G，研究ampG基兇在野生型銅綠假單胞菌耐藥中的作用;
　　9、以PA1280△G為受體，分別用PAO1和PA1280的ampG基因進(jìn)行回補(bǔ)，并檢測敲除株和回補(bǔ)株對各抗生素的MIC。
　　結(jié)果:
　　1、根據(jù)瓊脂稀釋法測得的氨芐西林MIC結(jié)果，211株銅綠假單胞菌被分為氨芐西林低抗(MIC≤512μg/ml)、中抗(512μg/ml＜MIC＜4096μg/m

9、l)和高抗（MIC≥4096μg/ml）三個梯度，其中低抗組44株、中抗76株、高抗91株。
　　2、提取60株基因組進(jìn)行ampG基因的克隆，將克隆送測序，測序成功59株;
　　3、用BioEdit軟件將59條測序成功的序列與參考序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)有36株在58個位點(diǎn)上發(fā)生了96次堿基置換，其中C-T間的轉(zhuǎn)換占50％（48次），G-A間的轉(zhuǎn)換為25％（24次），余為堿基顛換。在發(fā)生的58個點(diǎn)突變中，有10個引起了氨基酸的改變

10、;
　　4、挑取36條測序成功的ampG序列構(gòu)建表達(dá)載體，以PAO1△G為受體進(jìn)行回補(bǔ)實驗，重組子氨芐西林的MIC基本上穩(wěn)定在512μg/ml;
　　5、將保守性氨基酸I53、W90這2個位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變研究后，遺傳回補(bǔ)實驗結(jié)果顯示與PAO1相比，I53位點(diǎn)異亮氨酸-絲氨酸和異亮氨酸-蘇氨酸的突變體對氨芐西林的MIC及其β-內(nèi)酰胺酶活性明顯下降，說明該位點(diǎn)氨基酸的突變可能造成了ampG基因轉(zhuǎn)錄異?；駻mpG蛋白構(gòu)象的異常，

11、從而抑制了其轉(zhuǎn)運(yùn)底物的活性;
　　6、將CCCP分別與美羅培南、氨芐西林、氯霉素和四環(huán)素聯(lián)合使用，檢測了包括PAO1在內(nèi)的25株野生型銅綠假單胞菌的M1C。有8株原本對美羅培南耐藥的表現(xiàn)為敏感，有4株仍為耐藥;對于氨芐西林則有15株由耐藥轉(zhuǎn)為敏感;氯霉素也有16株由耐藥轉(zhuǎn)為敏感;CCCP對四環(huán)素的作用最小;無論哪種藥物，PAO1的MIC改變都不顯著;
　　7、將包括外排泵抑制劑及其相似物在內(nèi)的90種臨床來源藥物與氨芐西林聯(lián)合

12、使用，檢測其對PAO1的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)有19種藥物可以與氨芐西林產(chǎn)生協(xié)同作用，包括14種抗生素和5種非抗生素類臨床用藥。但同CCCP一樣，臨床藥物來源類的常規(guī)外排泵抑制劑與氨芐西林聯(lián)用對PAO1沒有明顯的協(xié)同作用;
　　8、將野生型銅綠假單胞菌PA1280的ampG基因敲除后，其氨芐西林抗性由＞8192μg/ml降至4100μg/ml，雖然效果顯著，但不能完全阻斷對氨芐西林的抗性，且對其它抗生素的影響也微乎其微。另外，與PAO1△

13、G不同，敲除ampG基因的PA1280仍然具有β-內(nèi)酰胺酶的誘導(dǎo)性。分別用PA01及其自身的ampG基因回補(bǔ)后，可以完全重建野生型的耐藥水平。同樣，CCCP可以明顯提高PA1280的野生型及重組子對部分抗生素的敏感性。
　　結(jié)論:
　　銅綠假單胞菌ampG基因的自發(fā)突變率較高，但引起氨基酸改變的并不多，均可編碼有功能的AmpG，可知銅綠假單胞菌的ampG基因保守性較高;CCCP可以顯著提升部分抗生素對銅綠假單胞菌的抗菌活性;