整合子及β-內(nèi)酰胺酶基因介導(dǎo)的銅綠假單胞菌耐藥性研究.pdf

1、[目的]
　　 通過研究整合子系統(tǒng)及β-內(nèi)酰胺酶基因在銅綠假單胞菌臨床分離株中的分布及其在該菌耐藥中的作用，從基因水平探討銅綠假單胞菌的耐藥機制;分析銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子整合酶基因與群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控基因的相關(guān)性，初步探討Ⅰ類整合子的調(diào)控機制。
　　 [方法]
　　 1.采用紙片擴(kuò)散法檢測81株臨床分離的銅綠假單胞菌對12種常用抗生素的敏感性，了解該菌的耐藥情況。
　　 2.采用多重PCR方法檢測Ⅰ類、Ⅱ

2、類、Ⅲ類整合子在銅綠假單胞菌臨床分離株中的分布，并對整合子可變區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增、測序及比對分析，以明確其所攜帶的基因盒類型;探討整合子系統(tǒng)在銅綠假單胞菌耐藥性中的作用。
　　 3.采用PCR方法檢測β-內(nèi)酰胺酶基因(KPC-2、TEM、SHV、NDM、VIM、IMP)在23株多重耐藥銅綠假單胞菌中的分布，并對相應(yīng)基因進(jìn)行測序分析，探討β-內(nèi)酰胺酶基因在該菌多重耐藥性中的作用。
　　 4.以亞抑菌濃度的阿奇霉素干擾銅綠假單胞

3、菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，采用熒光定量RT-PCR方法檢測銅綠假單胞菌的Ⅰ類整合子整合酶基因（intI1）與群體感應(yīng)系統(tǒng)基因（LasR、RhlI、RhlR）的mRNA表達(dá)水平，分析前者與后者的相關(guān)性;初步探討Ⅰ類整合子是否受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。
　　 [結(jié)果]
　　 1.81株銅綠假單胞菌對所選12種抗生素的耐藥率依次為:慶大霉素45.7％，左旋氧氟沙星42％，氨曲南39.5％，環(huán)丙沙星33.3％，哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦28

4、.4％，頭孢他啶26％，阿米卡星和頭孢吡肟21％，亞胺培南19.8％，妥布霉素13.6％，美羅培南11.1％;其中23株(28.2％)銅綠假單胞菌對上述12種抗生素表現(xiàn)為多重耐藥。
　　 2.81株銅綠假單胞菌中，有30株(37％)攜帶Ⅰ類整合子，未發(fā)現(xiàn)Ⅱ類、Ⅲ類整合子;在30株Ⅰ類整合子陽性菌中檢測到19株(63.3％)攜帶整合子相關(guān)基因盒，基因盒的類型及排列方式如下:aadA4a（9株）、aacA4-catB8-aadA1(

5、3株)、aac(6')-lai-orfv-aadA1-qacEΔ1-sul(2株)、blaIMP-6-qac-aacA4-OXA-1-aadA1-qacEΔ1-sul（3株）。另外有2株菌攜帶的不是耐藥基因盒，而是編碼ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)蛋白和噬菌體蛋白的基因。
　　 3.23株多重耐藥銅綠假單胞菌中，有14株(60.9％)攜帶β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)基因，其中5株攜帶TEM-1基因，3株攜帶SHV-5a基因，3株攜帶IMP-1基因，2株攜帶

6、VIM-2基因，1株攜帶NDM-1基因;而針對KPC-2基因的擴(kuò)增，有2株菌PCR產(chǎn)物陽性，測序比對與GeneBank登錄號AP012280.1的序列相似度高達(dá)98％，后者是高度耐受碳青霉烯類的Pseudomonas aeruginosa NCGM2.S1菌的一段序列，但是未能確定與KPC型基因的關(guān)系。
　　 4.在亞抑菌濃度的阿奇霉素作用下，銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的三個調(diào)控基因LasR、RhlI、RhlR均有不同程度的下降，

7、并且表現(xiàn)出了劑量依賴關(guān)系;檢測銅綠假單胞菌的Ⅰ類整合酶基因，發(fā)現(xiàn)隨著阿奇霉素濃度的增高，其intI1mRNA表達(dá)量總體呈現(xiàn)下降趨勢，與LasR、RhlI、 RhlR三個基因的mRNA表達(dá)水平比較，前者與后者呈現(xiàn)了正相關(guān)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.81株銅綠假單胞菌臨床分離株中，有23株表現(xiàn)為多重耐藥。
　　 2.Ⅰ類整合子及相關(guān)耐藥基因盒在銅綠假單胞菌臨床分離株中廣泛分布，Ⅰ類整合子陽性菌株的耐藥率明顯高于陰性

8、株的，提示整合子系統(tǒng)與該菌的耐藥性密切相關(guān);Ⅰ類整合子攜帶的基因盒以氨基糖苷類修飾酶基因為主;在銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子中檢測出了攜帶blaIMP-6-qac-aacA4-OXA-1-aadA1-qacEΔ1-sul;并發(fā)現(xiàn)2株菌Ⅰ類整合子攜帶編碼ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)蛋白和噬菌體蛋白的基因，它們是否參與細(xì)菌耐藥，還有待進(jìn)一步研究。
　　 3.TEM、SHV、VIM、IMP型的β-內(nèi)酰胺酶基因在多重耐藥銅綠假單胞菌中分布較為廣泛;在該菌中