尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病大鼠BM-MSC培養(yǎng)鑒定及增殖分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制.pdf

1、背景與目的:尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病與尿毒癥狀態(tài)下成骨細(xì)胞數(shù)量及功能的異常增加有密切關(guān)系，其確切機制目前尚未明確。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)增殖并向成骨細(xì)胞分化是骨形成的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，但目前尚無尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病大鼠BM-MSC體外培養(yǎng)及增殖、分化的報道。我們最近首次發(fā)現(xiàn)尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的能力增加。本研究通過體外培養(yǎng)、鑒定尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病大鼠BM-MSC，觀察其增殖、分化行為特征及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制改變。

2、r>　　 方法:取180-200g Sprague-Dawley雄性大鼠，制做5/6腎切除并高磷飲食（磷1.2％，鈣1.0％）喂養(yǎng)的尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病組模型大鼠。以正常磷飲食(0.9％，鈣1.0％)喂養(yǎng)的相同體重雄性大鼠作為對照組。12周后處死大鼠，取股骨和脛骨骨干，利用骨片貼壁分離篩選法原代培養(yǎng)BM-MSC。取第3代細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀鑒定BM-MSC分子標(biāo)志(CD90+/CD34-/CD44+/CD45-)。采用MTT法觀察尿毒癥高

3、轉(zhuǎn)化骨病組大鼠與對照組大鼠BM-MSC細(xì)胞增殖行為改變，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀法檢測BM-MSC中DNA含量，分析兩組細(xì)胞之間細(xì)胞周期的差異。免疫組化及免疫印跡法(western-blot)檢測兩組細(xì)胞之間增殖相關(guān)信號通路分子表達(dá)的差異。在含有磷酸甘油及地塞米松的成骨培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)BM-MSC分化為成骨細(xì)胞，采用免疫組化法，分析比較尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病組與對照組BM-MSC分化的成骨細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)的差異，采用vo

4、n Kossa染色觀察兩組細(xì)胞內(nèi)外磷酸鈣沉積及骨結(jié)節(jié)形成數(shù)目（HE染色）等成骨細(xì)胞特征性標(biāo)志物的差異。
　　 結(jié)果:(1)利用骨片貼壁分離篩選法可成功分離、培養(yǎng)尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病組大鼠及對照組大鼠的原代BM-MSC。取第3代培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定為CD90+/CD34-/CD44+/CD45-細(xì)胞，符合BM-MSC的分子標(biāo)志特征。(2)流式細(xì)胞術(shù)對DNA的分析發(fā)現(xiàn)，尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病組大鼠BM-MSC中G1期、S期、G2/M期、

5、細(xì)胞比例分別為79.55±3.66％、20.12±1.96％、0.33±0.10％，對照組分別為84.62±3.10％、15.13±0.87％、0.25±0.11％，尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病組S期細(xì)胞比例明顯增加(P＜0.05)，此結(jié)果與MTT法的細(xì)胞增殖分析結(jié)果一致。(3)免疫組化結(jié)果顯示，培養(yǎng)的BM-MSC中，ERK1/2信號通路明顯激活，表現(xiàn)為p-ERK1/2與總ERK1/2的比值顯著增加(P＜0.05)。Western-blot分析顯示

6、，對照組BM-MSC細(xì)胞ERK1/2信號通路的激活從72h開始，并在其后的24h內(nèi)維持于較高水平;而尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病組細(xì)胞ERK1/2信號通路激活從48h即已開始，并在其后的48h內(nèi)一直維持于較高水平;在48h-96h內(nèi)的各時間點，尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病組ERK1/2信號通路的激活水平均高于對照組(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，使用ERK1/2信號通路阻斷劑后，兩組細(xì)胞增殖能力均顯著下降，尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病組S期細(xì)胞比例的下降程度較對照組

7、更為顯著(P＜0.05)，此結(jié)果與MTT法分析結(jié)果一致。(4)免疫組化法顯示，大鼠BM-MSC于體外向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后1周，細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)明顯增強;分化后2周，骨橋蛋白(OPN)表達(dá)明顯增強(P＜0.05)，von Kossa染色顯示，細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)磷酸鈣沉積較對照組顯著增多(P＜0.05);分化后3周，骨結(jié)節(jié)形成數(shù)目有明顯增加(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:尿毒癥高轉(zhuǎn)化骨病大鼠BM-MSC可在體外培養(yǎng)條件下存活，