Myostatin負調(diào)控成肌細胞增殖和分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究.pdf

1、肌肉生長抑制素(Myostatin)，簡稱肌抑素，屬TGF-β超家族的一員，它是骨骼肌生長發(fā)育的負調(diào)控因子。本研究旨在以小鼠成肌細胞系C2C12細胞為模型，探討Myostatin負調(diào)控成肌細胞增殖和分化的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號途徑。本研究共包括以下五部分實驗： 實驗一Myostatin對JNK信號途徑的影響 在掌握C2C12細胞生長特性的基礎(chǔ)上，為體外研究Myostatin是否對JNK信號途徑產(chǎn)生影響并確定

2、其最佳添加濃度，首先利用不同濃度的重組鼠Myostatin蛋白處理C2C12細胞，1h后收集細胞提取總蛋白，利用磷酸化JNK抗體進行Westernblot分析。結(jié)果表明，添加50ng/mL重組鼠Myostatin蛋白組的雜交信號最強。確定最佳添加濃度后，為進一步研究細胞在增殖和分化過程中Myostatin是否對JNK信號途徑產(chǎn)生影響及了解這種影響是否具有時間效應(yīng)，分別在增殖和分化兩種培養(yǎng)條件下利用50ng/mL重組鼠Myostatin蛋

3、白處理C2C12細胞不同時間，然后在不同時間點收集細胞提取總蛋白，利用多種抗體進行Westernblot分析。結(jié)果表明：增殖過程中，細胞內(nèi)JNK磷酸化水平在Myostatin作用20min出現(xiàn)輕微提高，在1h達到最大，隨后逐漸下降；分化過程中，細胞內(nèi)JNK磷酸化水平在Myostatin作用20min出現(xiàn)第一次提高，在40min回落到對照組水平，在1h后出現(xiàn)第二次提高并持續(xù)到4h；細胞增殖和分化過程中，Myostatin激活JNK這一事件

4、被Myostatin激活c-Jun(JNK信號途徑下游信號分子)進一步所證實，并且細胞內(nèi)c-Jun磷酸化水平的變化具有與JNK磷酸化水平變化相類似的規(guī)律；細胞增殖和分化過程中，JNK總蛋白水平在各處理前后維持恒定。本實驗首次證實了C2C12細胞增殖和分化過程中Myostatin能夠激活JNK信號途徑。 實驗二ActRⅡB在Myostatin激活JNK中的作用 為獲得能夠有效下調(diào)ActRⅡB基因表達的小干擾RNA(siRN

5、A)分子，采用陽性對照GAPDHsiRNA確定的最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件，將三對用于下調(diào)ActRⅡB基因表達的siRNA(AmbionsiRNAID59935、ID60120或ID162114)轉(zhuǎn)染到C2C12細胞中，48h后收集細胞提取總RNA，利用實時熒光定量PCR方法分析細胞內(nèi)ActRⅡB基因表達的變化。結(jié)果表明：和對照組相比，AmbionsiRNAID59935、ID60120和ID162114分別下調(diào)了細胞內(nèi)ActRⅡB基因的mRN

6、A表達水平46.68％、27.46％和60.92％。為研究Myostatin激活JNK是否由ActRⅡB所介導(dǎo)，采用最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件，將AmbionsiRNAID162114轉(zhuǎn)染到C2C12細胞中，48h后添加50ng/mL重組鼠Myostatin蛋白處理1h，然后收集細胞提取總蛋白，利用磷酸化JNK抗體進行Westernblot分析。結(jié)果表明，有效下調(diào)ActRⅡB基因表達后，Myostatin激活JNK的程度受到顯著地削弱。本實驗證

7、實了Myostatin激活JNK是由ActRⅡB所介導(dǎo)。 實驗三TAK1-MKK4信號通路在Myostatin激活JNK中的作用 為獲得能夠高效下調(diào)TAK1和MKK4基因表達的小干擾RNA(siRNA)分子，采用最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件，分別將三對用于下調(diào)TAK1基因表達的siRNA(AmbionsiRNAID94455、ID94549或ID189006)和三對用于下調(diào)MKK4基因表達的siRNA(AmbionsiRNAID6

8、4447、ID64539或ID186583)轉(zhuǎn)染到C2C12細胞中，48h后收集細胞提取總RNA，利用實時熒光定量PCR方法分析細胞內(nèi)TAK1和MKK4基因表達的變化。結(jié)果表明：和對照組相比，AmbionsiRNAID94455、ID94549和ID189006分別下調(diào)了細胞內(nèi)TAK1基因的mRNA表達水平33.34％、46.73％和79.97％，AmbionsiRNAID64447、ID64539和ID186583分別下調(diào)了細胞內(nèi)MK

9、K4基因的mRNA表達水平85.19％、79.18％和69.59％。為研究Myostatin激活JNK是否由TAK1和MKK4所介導(dǎo)，采用最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件，分別將AmbionsiRNAID189006或AmbionsiRNAID64447轉(zhuǎn)染到C2C12細胞中，48h后添加50ng/mL重組鼠Myostatin蛋白處理1h，然后收集細胞提取總蛋白，利用多種抗體進行Westernblot分析。結(jié)果表明，高效下調(diào)TAK1基因表達后，JNK

10、被Myostatin激活的程度受到削弱，而高效下調(diào)MKK4基因表達后，JNK幾乎不被Myostatin所激活。以上結(jié)果表明，Myostatin是通過TAK1-MKK4信號通路而激活JNK。 實驗四JNK信號途徑在Myostatin負調(diào)控成肌細胞增殖和分化中的作用 采用MTT法進行細胞增殖分析，結(jié)果表明：和對照組相比，添加50ng/mL重組Myostatin蛋白處理C2C12細胞24h抑制了細胞增殖約20％(P=0.28)

11、，而添加10μmol/LJNK特異性抑制劑SP600125阻斷JNK信號途徑后，Myostatin則失去了抑制細胞增殖的能力。Myostatin抑制成肌細胞增殖常與p21基因表達上調(diào)密切相關(guān)。為檢測細胞增殖過程中Myostatin是否對p21基因表達產(chǎn)生影響，實驗對80％左右匯合的C2C12細胞用50ng/mL重組鼠Myostatin蛋白分別處理2h、4h和6h。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，Myostatin上調(diào)p21基因表達最佳作用時

12、間為4h。為檢測細胞增殖過程中JNK是否在Myostatin上調(diào)p21基因表達中發(fā)揮作用，實驗對80％左右匯合的C2C12細胞用10μmol/LSP600125預(yù)先處理1h后，再用50ng/mL重組Myostatin蛋白處理4h。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，p21基因表達mRNA水平在Myostatin處理4h后上調(diào)了約3.5倍，而存在SP600125時，Myostatin上調(diào)p21基因表達的能力則受到一定程度的削弱。Westernbl

13、ot分別結(jié)果表明，p21基因表達蛋白水平的變化與其mRNA水平的變化類似。Myostatin抑制成肌細胞分化常與分化相關(guān)基因表達下調(diào)密切相關(guān)。為檢測JNK是否在Myostatin下調(diào)分化相關(guān)基因表達中起作用，C2C12細胞在增殖培養(yǎng)液生長至80％左右匯合時，更換為分化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后于分化培養(yǎng)條件下用10μmol/LSP600125預(yù)先處理1h后，再用50ng/mL重組Myostatin蛋白處理24h，分別利用實時熒光定量PC

14、R和Westernblot分析分化標志基因myogenin和MyoD基因表達mRNA和蛋白水平的變化。結(jié)果表明，myogenin基因表達mRNA和蛋白水平分別在Myostatin處理24h后下調(diào)了40％和80％，MyoD基因表達mRNA和蛋白水平分別在Myostatin處理24h后下調(diào)了25％(P=0.13)和63％，而存在SP600125時，Myostatin下調(diào)myogenin和MyoD基因表達的能力均受到一定程度的削弱。以上結(jié)果表

15、明，JNK信號途徑在Myostatin負調(diào)控成肌細胞增殖和分化中發(fā)揮了重要作用。 實驗五MKK4siRNA對Myostatin下調(diào)分化相關(guān)基因表達的影響 在分化培養(yǎng)條件下AmbionsiRNAID64447依然能夠高效下調(diào)MKK4基因表達的前提下，采用最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將MKK4基因特異的siRNA(AmbionsiRNAID64447)轉(zhuǎn)染到C2C12細胞中，48h后更換成含50ng/mL重組鼠Myostatin蛋白

16、的分化培養(yǎng)液再培養(yǎng)48h，然后收集細胞提取總蛋白，利用多種抗體進行Westernblot分析。結(jié)果表明，細胞內(nèi)myogenin和MyoD蛋白水平在Myostatin作用48h分別下降了82.54％和90.02％，但采用RNAi顯著下調(diào)MKK4基因表達后細胞內(nèi)myogenin和MyoD蛋白水平在Myostatin作用48h只分別下降了40.42％和24.38％。本實驗一方面進一步證實了JNK信號途徑在Myostatin負調(diào)控成肌細胞分化中

17、發(fā)揮了重要的作用，另一方面為尋求下調(diào)Myostatin活性提供了有益的思路。 總之，本研究首次揭示了Myostatin負調(diào)控成肌細胞增殖和分化的JNK信號途徑。首先，本研究證實了C2C12細胞增殖和分化過程中Myostatin能夠激活JNK信號途徑。其次，本研究證實了Myostatin是通過ActRⅡB受體再通過TAK1-MKK4信號通路而激活JNK。最后，本研究證實了激活的JNK信號途徑在Myostatin負調(diào)控成肌細胞增殖和