共培養(yǎng)DC-LAK細胞抗腫瘤作用及經(jīng)不同途徑回輸后在荷瘤小鼠體內(nèi)的動態(tài)分布.pdf

1、目的：本試驗采用小鼠肺癌腫瘤模型為研究對象。取小鼠骨髓細胞體外培養(yǎng)樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)，用腫瘤抗原活化DC成熟，與小鼠脾淋巴細胞誘導的淋巴因子激活殺傷細胞(Lymphokine activated killer cell，LAK)細胞共培養(yǎng)，觀察共培養(yǎng)細胞的抗腫瘤能力及回輸體內(nèi)后的組織器官分布特點。為今后在臨床聯(lián)合應用DC和LAK細胞治療肺癌提供試驗依據(jù)。 方法： 1培養(yǎng)小鼠肺癌腫瘤細胞株Le

2、wis lung carcinoma(LLC)，收集對數(shù)生長期的LLC細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×107/ml。以C57BL/6小鼠右側(cè)前肢腋下為注射部位，皮下注射單細胞懸液0.2ml，以建立小鼠腫瘤模型。 2取小鼠腫瘤組織，應用反復凍融法制備腫瘤抗原，使用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒進行LLC腫瘤抗原蛋白定量。 3.DC與LAK細胞的體外培養(yǎng)。從C57BL/6小鼠脛骨與股骨獲得骨髓細胞，用含有rmGM-CM-CSF 50ng/

3、ml和rmIL-4 25ng/ml的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天半量換液，并加相應細胞因子。培養(yǎng)至第七天的DC，加入LLC腫瘤抗原100mg/ml，48h后，收獲懸浮細胞，為活化DC。使用流式細胞儀檢測CD80、CD86的表達情況。于C57BL/6小鼠獲得脾臟，過400目鋼網(wǎng)制備脾細胞懸液。利用梯度離心法收獲脾淋巴細胞。用含rmIL-21000iu/ml的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至第七天，收獲細胞為LAK細胞。 4.DC-

4、LAK的共同培養(yǎng)。收獲的活化DC與LAK細胞，按1:5的比例混合，加入rmIL-2 500iu/ml、rmGM-CSF25ng/ml、rmIL-4 12.5ng/ml培養(yǎng)48h后收集，為共培養(yǎng)DC-LAK細胞。 5共培養(yǎng)DC-LAK體外殺傷實驗。效應細胞為LAK細胞組和與腫瘤抗原致敏DC共培養(yǎng)LAK細胞(DC-LAK)，靶細胞為LLC細胞，分別按效靶比20:1、40:1的條件下用MTT法檢測兩種細胞的殺傷活性。 6回輸外

5、源性殺傷細胞。荷瘤C57BL/6小鼠48只，于注射LLC后10天，回輸經(jīng)CFSE標記的外源性殺傷細胞。荷瘤小鼠隨機分為瘤旁皮下注射和腹腔注射2組，各組再隨機分為DC-LAK組與LAK組，各組再隨機分為4組(1h、4h、24h、72h)，每組3只，每只分別經(jīng)瘤旁皮下注射或腹腔注射CFSE標記的DC-LAK細胞或LAK細胞3×107/0.2ml。7外源性殺傷細胞體內(nèi)分布的檢測。各組荷瘤小鼠分別于回輸外源性殺傷細胞后1h、4h、24h、72h

6、，取外周血、肝臟、脾臟、肺臟與腫瘤。肝臟、脾臟、肺臟與皮下腫瘤過200目鋼網(wǎng)，加入與原重量相等的PBS重懸。外周血按體積用PBS1:1稀釋。處理好的血，肝臟，脾臟，肺臟與皮下腫瘤各樣本取10μl，滴于載玻片上，上覆蓋玻片，每個樣本滴片3張。激光共聚焦熒光顯微鏡(Iaser scanning confocal microscope，LSM)下觀察成像(激發(fā)波長為488nm，熒光信號的檢測通道為505nm的長通濾光片)。于400倍視野下觀察

7、，每張玻片隨機選取10個視野，采集圖像，計數(shù)圖像中綠色熒光細胞。以3張玻片均數(shù)記為該樣本陽性細胞數(shù)。 結(jié)果： 1小鼠骨髓細胞培養(yǎng)9天后表面突起多樣化，細胞呈樹突狀。平均每只小鼠收獲DC6×106個。經(jīng)LLC腫瘤凍融抗原活化的DC，其表面CD80表達率為42.4％，CD86表達率為75.31％，CD80CD86共表達率為41.36％。 2.DC和LAK細胞混合培養(yǎng)48h.后形成DC-LAK細胞簇，少則數(shù)個細胞，多則

8、數(shù)十個細胞。 3外源性殺傷細胞對小鼠LLC肺癌細胞的體外殺傷活性。效應細胞與靶細胞為40:1時，單純LAK細胞組殺傷活性為(63.45±2.46％)，而經(jīng)LLC細胞抗原致敏的DC能誘導出LAK.細胞對LLC肺癌細胞更強的殺傷活性(81.02±2.18％)。兩者相比較差異有顯著性(p＜0.01)。當效應細胞與靶細胞為20:1時，DC-LAK細胞對LLC細胞的殺傷活性(75.10±3.68％)仍明顯高于LAK細胞的殺傷活性(57.9

9、2±2.11％)(p＜0.01)。4外源性殺傷細胞回輸荷瘤小鼠體內(nèi)的分布。 (1)外源性殺傷細胞經(jīng)腹腔注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，標記的DC-LAK細胞于回輸后1h時，在肺臟內(nèi)的分布達到峰值；4h時，肝臟和脾臟內(nèi)的分布達到峰值；24h時，腫瘤內(nèi)的分布達到峰值，此時腫瘤內(nèi)的分布高于其他臟器(p＜0.05)。72h時，此時脾臟內(nèi)分布最多(p＜0.05)。在整個觀測過程中，外周血中的分布始終很低。與LAK細胞組相比，在1h、4h、24

10、h時腫瘤內(nèi)的分布DC-LAK組高于LAK組(p＜0.05)。在72h時腫瘤內(nèi)的分布兩組無統(tǒng)計學差異。 (2)外源性殺傷細胞經(jīng)瘤旁皮下注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，標記的DC-LAK細胞于回輸后1h時，在肺臟內(nèi)的分布達到峰值；4h時，肝臟內(nèi)的分布達到峰值；24h時，腫瘤脾臟內(nèi)的分布達到峰值，此時腫瘤內(nèi)的分布高于其他臟器(p＜0.05)。72h時，腫瘤脾臟內(nèi)分布最多。在整個觀測過程中，外周血中的分布始終很低。與LAK細胞組相比，在1h

11、、4h、24h時腫瘤內(nèi)的分布DC-LAK組高于LAK組(p＜0.05)。在72h時腫瘤內(nèi)的分布兩組無統(tǒng)計學差異。 (3)兩種回輸途徑回輸?shù)谋容^。腹腔注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，DC-LAK細胞主要分布于肝臟和脾臟中；瘤旁皮下注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，DC-LAK細胞主要分布于腫瘤中。在各觀測時間點，DC-LAK細胞在腫瘤內(nèi)的分布瘤旁皮下注射組均高于腹腔注射組(p<0.05)。 結(jié)論： 1.小鼠骨髓細胞體外聯(lián)合應

12、用rmGM-CSF和rmIL-4培養(yǎng)，經(jīng)腫瘤細胞凍融抗原致敏，可以誘導擴增出較多數(shù)量、較高純度的樹突狀細胞，可滿足一般試驗的要求。 2.腫瘤凍融抗原致敏DC誘導的LAK細胞對小鼠LLC細胞具有高效的特異性殺傷作用。 3.DC-LAK細胞經(jīng)腹腔注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，主要分布于肝臟和脾臟中；經(jīng)瘤旁皮下注射途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，主要分布于腫瘤組織中。DC與LAK細胞共培養(yǎng)后經(jīng)兩種途徑回輸荷瘤小鼠體內(nèi)后，均可提高LAK細