腫瘤細(xì)胞來源鈣網(wǎng)蛋白誘導(dǎo)荷瘤小鼠體內(nèi)MDSCs富集的機制研究.pdf

1、鈣網(wǎng)蛋白（CRT）是主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保守蛋白，細(xì)胞生物學(xué)功能廣泛，在病理狀況下也會被釋放到細(xì)胞外空間。已有的證據(jù)表明，CRT在許多腫瘤組織以及腫瘤患者的體液中高表達(dá)，既在腫瘤生成過程中發(fā)揮作用，又在抑制血管生成、參與腫瘤免疫監(jiān)視與清除的過程中扮演著重要角色。因此本實驗室前期工作利用小鼠黑色素瘤(B16)系統(tǒng)研究了可溶性 CRT對腫瘤體內(nèi)外生長的影響，結(jié)果顯示可持續(xù)分泌可溶性CRT的B16細(xì)胞(B16-CRT)體外的增殖、遷移以及粘附能

2、力與其對照細(xì)胞（B16-EGFP）無顯著差異，但其體內(nèi)成瘤性要明顯強于對照細(xì)胞，并且誘導(dǎo)一群髓系來源的抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived Suppressor Cells，MDSCs)在脾臟、血液以及腫瘤組織中富集。進(jìn)一步利用裸鼠以及MDSCs缺失小鼠的成瘤模型證明MDSCs在B16-CRT荷瘤小鼠體內(nèi)富集是B16-CRT具有強成瘤性的關(guān)鍵因素。因此本課題主要探討腫瘤微環(huán)境來源的CRT富集MDSC的可能分子機制。
　　本研

3、究首先區(qū)分了在 B16-CRT荷瘤小鼠外周富集的MDSCs細(xì)胞亞群為G-MDSC(CD11b+Ly6G+Ly6Clow)，而對 M-MDSC(CD11b+Ly6G-Ly6Chigh)無顯著影響，因此本課題主要圍繞 CRT對 G-MDSC分化及功能的影響進(jìn)行探討。MDSCs在體內(nèi)的分布和富集主要由機體通過以下三個環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控：骨髓細(xì)胞向MDSCs方向的分化和增殖；外周MDSCs的存活；MDSCs向其他髓系終末端細(xì)胞亞群的分化，包括巨噬細(xì)胞

4、，樹突狀細(xì)胞等。本研究從體內(nèi)、外兩個層面對CRT誘導(dǎo)MDSCs的三方面富集機制進(jìn)行探討。首先利用BrdU體內(nèi)摻入的方法比較了B16-CRT與B16-EGFP荷瘤小鼠骨髓中各MDSCs亞群的增殖能力，結(jié)果顯示 B16-CRT荷瘤小鼠骨髓中的 G-MDSC增殖速度顯著高于 B16-EGFP荷瘤小鼠，并且體外利用CRT直接作用于小鼠骨髓細(xì)胞，也可促進(jìn)G-MDSC的增殖。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用過繼轉(zhuǎn)移模型驗證了骨髓細(xì)胞在已建立的B16-CRT荷

5、瘤小鼠體內(nèi)向G-MDSC的分化速度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)強于其在B16-EGFP荷瘤小鼠體內(nèi)的分化速度。B16-CRT以及B16-EGFP荷瘤小鼠脾臟以及外周血中的MDSCs的存活率并無顯著差別，但體外CRT可抑制MDSCs的凋亡，提示CRT促進(jìn)MDSCs的存活可能是其導(dǎo)致MDSCs在荷瘤小鼠體內(nèi)富集的因素之一。對荷瘤小鼠的脾臟以及外周血中的各髓系細(xì)胞比例分析發(fā)現(xiàn)，B16-CRT荷瘤小鼠脾臟以及外周血中的 DC細(xì)胞比例顯著低于對照小鼠，提示CRT可能抑

6、制了MDSCs向DC的分化，進(jìn)一步利用體外實驗驗證了CRT本身具有抑制MDSCs向DC分化的能力。此外本實驗室前期研究中還發(fā)現(xiàn)在腫瘤局部組織MDSCs細(xì)胞在B16-CRT荷瘤小鼠中也顯著富集，本課題利用體外Transwell系統(tǒng)證明了CRT本身可促進(jìn)MDSCs細(xì)胞的遷移。以上結(jié)果證明 CRT可通過促進(jìn)骨髓中 MDSCs的增殖，促進(jìn)外周組織中 MDSCs的存活，以及抑制MDSCs向DC的分化誘導(dǎo)荷瘤小鼠體內(nèi)MDSCs細(xì)胞的富集，并通過腫瘤

7、組織中的CRT趨化MDSCs向腫瘤組織中進(jìn)一步富集，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的成瘤。在此基礎(chǔ)上，本課題對CRT誘導(dǎo)荷瘤小鼠MDSCs富集的分子機制進(jìn)行了進(jìn)一步探索。由于TLR4是可溶性CRT的重要受體之一，且表達(dá)于MDSCs表面并發(fā)揮重要作用，我們首先考察了B16-CRT體內(nèi)的強成瘤性在TLR4-/-小鼠體內(nèi)是否存在。結(jié)果顯示，B16-CRT在TLR4-/-小鼠體內(nèi)成瘤性與B16-EGFP無顯著性差異，并且對MDSCs細(xì)胞的富集作用也可被

8、顯著逆轉(zhuǎn)，提示TLR4可能是介導(dǎo)腫瘤來源CRT富集MDSCs的主要受體。進(jìn)一步利用來源于TLR4-/-荷瘤小鼠的MDSCs驗證了CRT促進(jìn)骨髓中MDSCs的增殖，抑制MDSCs向DC的分化以及誘導(dǎo)MDSCs細(xì)胞的遷移均依賴于TLR4受體。據(jù)文獻(xiàn)報道，S100A8/9是髓系細(xì)胞分泌的一類重要的細(xì)胞因子，其對MDSCs細(xì)胞的增殖、分化及遷移均有直接的影響。本課題的研究結(jié)果顯示CRT可誘導(dǎo)MDSCs細(xì)胞表達(dá)S100A8/9，且這種刺激作用依賴