回輸不同極化類型的巨噬細(xì)胞對小鼠肝纖維化的治療作用和機(jī)制的研究.pdf

1、【背景】
　　肝纖維化由各種持續(xù)的慢性肝損傷導(dǎo)致,其漸進(jìn)性發(fā)展最終可形成肝硬化,甚至誘發(fā)肝癌,嚴(yán)重危害人們的生命健康。針對晚期肝硬化的有效治療手段十分有限,但有效的治療可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化,甚至恢復(fù)肝臟正常的結(jié)構(gòu)和功能。因此,探索治療肝纖維化的有效方法具有重要意義。目前,針對肝纖維化的細(xì)胞治療具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
　　肝纖維化是肝內(nèi)膠原纖維異常沉積的過程,是肝損傷后的傷口愈合反應(yīng)。各種慢性肝臟疾病,導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死和凋亡

2、,招募多種炎癥細(xì)胞浸潤。在肝內(nèi)多種細(xì)胞的相互作用下,肝星形細(xì)胞活化,其合成和分泌大量細(xì)胞外基質(zhì),基質(zhì)生成和降解失衡、大量沉積,導(dǎo)致肝纖維化。而在此過程中,巨噬細(xì)胞發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
　　巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞。在肝纖維化的發(fā)展過程中,巨噬細(xì)胞起著雙刃劍的作用。一方面,活化的巨噬細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子,導(dǎo)致肝星形細(xì)胞激活并合成分泌大量膠原蛋白;另一方面,巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶類,降解膠原纖維,誘發(fā)肝星形細(xì)胞凋亡,促進(jìn)

3、肝纖維化的消融緩解。提示纖維化過程中,巨噬細(xì)胞的功能復(fù)雜多樣,具有一定的異質(zhì)性。大量研究表明,活化的巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典激活的M1型巨噬細(xì)胞和替代激活的M2型巨噬細(xì)胞。二者對肝纖維化的作用不同,分別具有抗纖維化和促進(jìn)纖維化的作用。目前的研究表明,骨髓來源的巨噬細(xì)胞回輸對肝纖維化具有一定的緩解作用,但關(guān)于不同極化類型巨噬細(xì)胞對肝纖維化的治療研究尚未見報道。因此,本課題擬培養(yǎng)骨髓來源的巨噬細(xì)胞,用不同因子刺激誘導(dǎo)成為不同極化類型,將其回輸給肝

4、纖維化模型小鼠,觀察其對肝纖維化的作用,并探討其機(jī)制。
　　【目的】
　　1.研究不同極化類型的巨噬細(xì)胞回輸對小鼠肝纖維化的影響。
　　2.研究不同極化類型的巨噬細(xì)胞回輸參與肝纖維化治療的機(jī)制。
　　【方法】
　　1.CCl4腹腔注射建立小鼠肝纖維化模型。
　　2.建立巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)和極化誘導(dǎo)的方法。
　　3.用PEI-SPIO/Cy3-RNA復(fù)合物標(biāo)記巨噬細(xì)胞,追蹤巨噬細(xì)胞回輸后在肝臟中的定

5、位。
　　4.回輸不同極化類型的巨噬細(xì)胞,用天狼星紅染色、肝臟羥脯氨酸測定、Desmin免疫組化染色和血清白蛋白檢測等方法評價細(xì)胞回輸后肝纖維化程度的變化和治療效果。
　　5.實時定量 PCR、流式細(xì)胞術(shù)及明膠酶譜法檢測不同極化類型的巨噬細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶和巨噬細(xì)胞趨化因子配體的表達(dá)水平。
　　6.不同極化類型巨噬細(xì)胞回輸后,用實時定量 PCR檢測肝臟組織中巨噬細(xì)胞趨化因子配體和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)、用免疫組化檢測肝

6、臟組織中 F4/80+巨噬細(xì)胞的浸潤數(shù)量、測定尿液中羥脯氨酸的含量。
　　【結(jié)果】
　　1.成功建立小鼠肝纖維化模型;成功獲得骨髓來源的巨噬細(xì)胞,并在不同誘導(dǎo)條件下得到M1和M2型巨噬細(xì)胞;尾靜脈回輸巨噬細(xì)胞可定位于肝纖維化區(qū)域。
　　2.天狼星紅染色、肝臟羥脯氨酸測定、Desmin免疫組化染色和血清白蛋白水平顯示,M0和M1型巨噬細(xì)胞回輸組小鼠肝臟膠原纖維沉積減少,其中M1型巨噬細(xì)胞回輸組減少更明顯,小鼠肝功能更好。

7、提示M1型巨噬細(xì)胞回輸對肝纖維化有更好的治療效果。
　　3.M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)MMP-2、9、13和CCL2、CCL3。
　　4.M1型細(xì)胞回輸組小鼠肝臟組織中高表達(dá)CCL2、CCL3和MMP-2、9、13,F4/80+巨噬細(xì)胞浸潤增多,尿液中羥脯氨酸含量最高。
　　【結(jié)論】
　　1.M1和M0型巨噬細(xì)胞均可緩解小鼠肝纖維化,尤以回輸M1型細(xì)胞療效更為顯著。
　　2.M1型巨噬細(xì)胞本身高表達(dá)的MMPs分子