熊果酸抗腫瘤及作為小鼠肝癌細(xì)胞疫苗佐劑的作用研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一。目前主要的治療方法包括手術(shù)、化療和放療等,但其毒副作用大,療效差。因此,尋找毒副作用小、安全、高效的腫瘤治療方法是目前腫瘤研究的重要趨勢(shì)。
　　熊果酸(Ursolic acid,UA)是存在于天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物,具有多種生物學(xué)功效。近年來研究發(fā)現(xiàn)熊果酸具有抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能作用。目前,其具體的抗腫瘤作用機(jī)制并不明確。本文研究了熊果酸體外抗腫瘤作用機(jī)制,體內(nèi)腫瘤免疫調(diào)節(jié)作

2、用及作為佐劑的腫瘤免疫預(yù)防作用,為熊果酸在抗腫瘤領(lǐng)域深入的應(yīng)用開發(fā)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。論文主要研究內(nèi)容及結(jié)論如下:
　　1.熊果酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞體外增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用研究
　　目的：探討熊果酸對(duì)體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　方法：MTT法測定熊果酸對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)分析熊果酸作用HeLa細(xì)胞后細(xì)胞周期的變化及細(xì)胞凋亡情況;Western blot檢測熊果酸作用 HeLa細(xì)胞后

3、caspase-3, caspase-8,caspase-9,cytochrome c,Bcl-2,Bcl-xL,Bak,Bax蛋白表達(dá)。Real-time PCR檢測了熊果酸對(duì)宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞中HPV E6和E7基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：熊果酸抑制 HeLa細(xì)胞增殖呈濃度依賴性,40μM熊果酸作用48h后細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)91.80±3.26％,IC50值為9.54±3.51μM。流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果顯示熊果酸阻滯HeL

4、a細(xì)胞周期在G0/G1期,40μM作用48h效果最顯著。熊果酸誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡呈濃度依賴性,40μM和60μM作用48h后,細(xì)胞早期凋亡率分別為74.30±5.26%和83.87±2.27%,顯著高于對(duì)照組2.20±1.15%(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示 UA作用 HeLa細(xì)胞引起caspase-3和caspase-9激活,可觀察到剪切形式的caspase-3和caspase-9出現(xiàn);細(xì)胞質(zhì)中cytochrom

5、e c蛋白表達(dá)量增加;Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達(dá)水平降低,Bax和Bak蛋白表達(dá)水平增加,均呈一定的時(shí)間依賴性。Procaspase-8蛋白表達(dá)量也降低,但未檢測到剪切形式的caspase-8條帶。Real-time PCR結(jié)果顯示宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中HPV E6基因的表達(dá)量均顯著降低(P<0.01),E7基因的表達(dá)未出現(xiàn)顯著性改變。表明,熊果酸在體外對(duì)宮頸癌細(xì)胞有較好的增殖抑制活性,可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到體外抗腫瘤作

6、用,對(duì)其抗凋亡途徑的研究表明UA可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。UA抗宮頸癌的靶點(diǎn)可能在于能夠抑制HPV病毒E6基因的表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　2.熊果酸誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡中MAPK信號(hào)通路作用及細(xì)胞因子的變化
　　目的：熊果酸誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制并不清楚。本文探討了MAPK信號(hào)通路在熊果酸誘導(dǎo) HeLa細(xì)胞凋亡中的作用及細(xì)胞凋亡中細(xì)胞因子變化。
　　方法：Western blot檢測了不同濃度熊果

7、酸作用HeLa細(xì)胞48h后MAPK信號(hào)通路中p38,p-p38,ERK, p-ERK,JNK,p-JNK蛋白的表達(dá); ERK1/2抑制子U0126對(duì)ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響和p38抑制子SB203580對(duì)p38,p-p38蛋白表達(dá)的影響;U0126和SB203580對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)Bax、Bcl-2、caspase-3、cytochrome c蛋白表達(dá)的影響;Real-time PCR檢測了熊果酸對(duì) DUSP基因表達(dá)的

8、影響;ELISA檢測熊果酸作用 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2、IL-4細(xì)胞因子含量。
　　結(jié)果：熊果酸降低p-ERK1/2和p-p38蛋白的表達(dá),呈濃度依賴性,對(duì)p-JNK蛋白的表達(dá)無改變;ERK1/2抑制子U0126顯著增強(qiáng)熊果酸誘導(dǎo)Bax/Bcl-2比率與熊果酸組比較(P<0.05),增強(qiáng)線粒體cytochrome c的釋放和剪切的Caspase-3蛋白的表達(dá);p38抑制子SB203580作用效果不明顯。Real-time P

9、CR結(jié)果顯示熊果酸增強(qiáng)DUSP1,2,4,5,6,7,9,10基因的表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示熊果酸改變細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的分泌但無規(guī)律性。表明,ERK1/2信號(hào)通路參與熊果酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,熊果酸可能通過增強(qiáng)DUSPs基因表達(dá),抑制ERK1/2和p38磷酸化來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)能夠通過改變細(xì)胞因子的分泌調(diào)控細(xì)胞凋亡。
　　3.熊果酸對(duì)小鼠肝癌H22移植瘤的抑制及免疫調(diào)節(jié)作用
　　目的：探討熊果酸對(duì)H22荷瘤小鼠抗腫瘤作用及

10、免疫功能的影響。
　　方法：體外細(xì)胞培養(yǎng),MTT法檢測熊果酸對(duì)H22細(xì)胞的增殖抑制率,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡作用;建立H22荷瘤小鼠動(dòng)物模型,根據(jù)小鼠體重,進(jìn)行區(qū)組隨機(jī)化分組,共分為模型組、環(huán)磷酰胺組(CTX,25mg/kg.d)、熊果酸高(40mg/kg.d)、中(20mg/kg.d)和低劑量(10mg/kg.d),腹腔注射連續(xù)給藥15天后處死小鼠,計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù),MTT法檢測T、B淋巴細(xì)胞增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測

11、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群含量及比例,ELISA法檢測白介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-4(IL-4)的表達(dá)量。
　　結(jié)果：體外熊果酸對(duì)H22細(xì)胞生長的增殖抑制呈濃度依賴性,最高抑制率達(dá)75.27±3.36%;誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡呈時(shí)間依賴性,20μM作用48h后的凋亡率為36.4%±0.2,與對(duì)照0.9%±0.1比較,存在極顯著性差異(P<0.01)。在體內(nèi),與模型組相比,高劑量的熊果酸可顯著抑制腫

12、瘤生長(P<0.01),降低荷瘤鼠異常增大的脾指數(shù)(P<0.05);高劑量熊果酸可顯著增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞增殖能力(P<0.01),顯著提高淋巴細(xì)胞亞群CD4+T細(xì)胞表達(dá)及CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群比例(P<0.01),對(duì)CD8+T細(xì)胞表達(dá)作用不明顯(P>0.05);高劑量熊果酸促進(jìn)血清IL-2、TNF-α表達(dá)(P<0.05),降低IL-4表達(dá)(P<0.01)。表明,熊果酸可抑制H22腫瘤細(xì)胞生長,在體內(nèi)可以提高荷瘤小鼠的免疫能力,其抗

13、腫瘤作用可能與其免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)。
　　4.熊果酸增強(qiáng)小鼠肝癌細(xì)胞免疫原性的作用
　　目的：探討熊果酸作為免疫佐劑對(duì)小鼠肝癌腫瘤疫苗免疫原性的增強(qiáng)作用。
　　方法：UA和H22細(xì)胞共培養(yǎng),制備肝癌細(xì)胞疫苗,免疫小鼠后建立肝癌模型,觀察腫瘤生長曲線,記錄小鼠存活情況,MTT法測定脾淋巴細(xì)胞增殖能力,ELISA法測定血清IL-2、IL-4細(xì)胞因子含量,流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群百分率,免疫熒光法測定血清中抗

14、腫瘤特異性抗體的產(chǎn)生,ELISA法測定特異性抗體的水平,Western blot檢測血清特異性抗體結(jié)合能力。
　　結(jié)果：免疫小鼠后,與模型組相比,荷瘤小鼠腫瘤的生長明顯抑制(P<0.05),小鼠的生命延長率明顯高于模型組(P<0.01);與模型組相比,T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖能力顯著升高(P<0.01),CD4+/CD8+T細(xì)胞含量比例明顯升高(P<0.01),血清中細(xì)胞因子IL-2、IL-4含量明顯升高(P<0.01)。免疫鼠

15、血清可檢測到較高水平特異性抗體,抗體亞型IgG2a/IgG1比值明顯升高(P<0.01);Western blot出現(xiàn)四條大小約為95kDa、60kDa、50kDa和34kDa雜交條帶。表明,UA作為佐劑能夠提高小鼠H22肝癌細(xì)胞疫苗的免疫原性,增強(qiáng)小鼠抗腫瘤細(xì)胞免疫和體液免疫能力。
　　綜上所述,熊果酸能夠通過線粒體內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡,ERK1/2信號(hào)通路在該過程中發(fā)揮重要作用。熊果酸能夠提高H22荷瘤小鼠的免疫調(diào)節(jié)能