GGTase-Ⅰ或FTase基因敲除在抑制K-ras突變誘導(dǎo)肺癌發(fā)生中的分子機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是目前發(fā)病率和病死率均很高的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響著人類健康。肺癌是一種基因病，癌基因激活和抑癌基因失活是其重要的分子事件。因此，闡明肺癌發(fā)生的分子機(jī)制，從分子水平阻斷其發(fā)生的相關(guān)鏈接具有極為重要的臨床意義。K-ras是目前研究最多的癌基因之一，在許多腫瘤中均存在K-ras基因的擴(kuò)增或過度表達(dá)，其中在肺腺癌中大約有50％左右的患者存在K-ras突變，說明其在肺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。深入研究K-ras基因在肺癌發(fā)生中的作用機(jī)制，盡早

2、阻斷其信號系統(tǒng)已成為近年來肺癌研究領(lǐng)域中一個新的熱點(diǎn)。 大約有100多種細(xì)胞內(nèi)蛋白具有CAAX基序，K-ras基因編碼蛋白屬于其中的一種，這些蛋白可以進(jìn)行多種轉(zhuǎn)錄后修飾，其中半胱氨酸殘基（C末端CAAX基序）可直接進(jìn)行異戊二烯化修飾。一部分CAAX蛋白，其末端可以在牛龍?；D(zhuǎn)移酶Ⅰ（GGTase-Ⅰ）的作用下進(jìn)行牛龍基化修飾，還有一部分CAAX蛋白，例如K-Ras，在法呢?；D(zhuǎn)移酶（FTase）的作用下進(jìn)行法尼基化修飾，其中的“

3、X”殘基表明這種CAAX蛋白是被法尼基化還是牛龍基化修飾：一般情況下，如果“X”是亮氨酸，這種蛋白就會被牛龍基化修飾，否則就會被法尼基化修飾。CAAX蛋白末端進(jìn)行異戊二烯化修飾后可以增強(qiáng)其蛋白羧基端的疏水性，進(jìn)而增強(qiáng)膜的親和力及與配體的結(jié)合能力，從而增強(qiáng)其生物學(xué)活性。FTase和GGTase-Ⅰ有一個相同的α亞單位，但是分別具有各自獨(dú)特的表明其底物特異性的β亞單位。例如，GGTase-Ⅰ是由Fnta編碼的一個α亞單位和Pggt1b編碼的

4、獨(dú)特的β亞單位組成。 GGTase-Ⅰ是許多真核細(xì)胞的必需酶，在果蠅和酵母菌種GGTase-Ⅰ酶的β亞單位的無效突變通常是致死性的。GGTase-Ⅰ缺乏導(dǎo)致生物死亡的主要原因是Rho1p和Cdc42p蛋白無法進(jìn)行牛龍基化，而這種牛龍基化在特定條件下可通過FTase進(jìn)行法尼基化彌補(bǔ)。RAS蛋白的法尼基化已引起學(xué)者的足夠重視，研究表明，Ras蛋白的法尼基化對其靶向定位于細(xì)胞膜上的結(jié)合位點(diǎn)和保持正常的轉(zhuǎn)化能力是非常必須的。在動物模型

5、中，法呢酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（FTIs）具有高效的抗腫瘤活性且毒性低，而在臨床試驗(yàn)中，F(xiàn)TIs的療效并不理想，其可能原因是FTase缺乏時RAS蛋白進(jìn)行了牛龍基化。許多研究已證實(shí)GGTIs能抑制多種K-ras突變腫瘤細(xì)胞株的增殖，同時研究還表明GGTIs能改善多發(fā)性硬化癥動物模型的表型以及抑制肝癌中肝炎病毒的復(fù)制等。 鑒于GGTase-Ⅰ和FTase在K-ras突變誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生中的作用以及前期研究結(jié)果，本研究旨在應(yīng)用條件性敲基因技術(shù)

6、建立動物模型，并運(yùn)用組織病理學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等研究手段，充分闡明條件性敲除GGTase-Ⅰ的β亞單位（Pggt1b）或FTase的β亞單位（Fntb）后，阻斷CAAX蛋白異戊二烯化修飾，從而抑制K-ras基因突變誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生的作用，為肺癌的基因治療提供科學(xué)依據(jù)。 目的: （1）利用條件性基因敲除技術(shù)建立符合人類肺癌病變特征的動物模型；（2）應(yīng)用組織病理學(xué)等方法觀察肺癌組織病理形態(tài)，探討Pggt1b或Fntb基因敲

7、除對K-ras基因突變誘導(dǎo)肺癌形成的抑制作用：（3）探討Pggt1b或Fntb基因敲除抑制K-ras基因突變誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制。 方法: 1.條件性敲基因動物模型的建立及其基因型驗(yàn)證 利用Cre/lox P系統(tǒng)條件性敲入K-ras基因，敲除GGTase-Ⅰ或Ftase基因，分別建立K-ras（KLSL）、GGTase-Ⅰ（Pggt1btfl/fl）和Ftase（Fntbfl/fl）條件性敲基因鼠模型。然

8、后以KLSL鼠和Pggt1bfl/fl鼠或Fntbfl/fl鼠雜交產(chǎn)生KLSLPggt1bfl/fl鼠和KLSLFntbfl/fl鼠，經(jīng)基因分型后篩選出符合要求的小鼠。應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行基因型驗(yàn)證。 2.實(shí)驗(yàn)動物分組 按基因型分為三組：即KLSL（A組）、KLSLPggt1bfl/fl（B組）和KLSLFntbfl/fl（C組），各組根據(jù)感染病毒種類的不同又分為兩個亞組即：cre腺病毒載體感染組（實(shí)驗(yàn)組：A1組、B1組和

9、C1組）和β-gal腺病毒載體感染組（對照組：A2組、B2組和C2組）。 3.干預(yù)方法 第14天齡時應(yīng)用霧化吸入法進(jìn)行腺病毒載體干預(yù)，分別敲除或激活KLSL、KLSLPggt1bfl/fl和KLSLFntbfl/fl基因。 4.稱量體重 病毒感染前及以后每周末稱量所有實(shí)驗(yàn)鼠體重。 5.各組動物生存率測定 自基因干預(yù)起，觀察各組動物的生存時間。 6.病理學(xué)檢查 不同時間點(diǎn)處死

10、動物，留取肺臟、肝臟、脾臟等組織器官并稱量其重量，一部分組織進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)；另一部分留取標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。 7.免疫組織化學(xué)染色 進(jìn)行CD4、CC10、CD8、SP-C、非異戊烯化Rap1A及Ki-67的免疫組織化學(xué)染色。 8.Real-time PCR 檢測肺臟、肝臟和脾臟等組織器官中Pggt1b、Fntb和KLSL等基因的mRNA表達(dá)水平。 9.Weste

11、rn blot 檢測肺臟腫瘤組織中非異戊烯化RAP1A、總RAP1A、p-ERK1/2、p-AKT、總AKT、總ERK1/2等的蛋白表達(dá)水平。 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 連續(xù)性數(shù)據(jù)用x+SD表示，離散數(shù)據(jù)用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示。三組間生存率的比較應(yīng)用Kaplan-Meier方法，其余指標(biāo)應(yīng)用單因素方差分析。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理（version11.0； SPSS Inc），P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)