羥基紅花黃色素A對(duì)谷氨酸損傷神經(jīng)元PPARγ的表達(dá)和活性的影響.pdf

1、研究目的：
　　1、探討谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的機(jī)制；
　　2、探討羥基紅花黃色素A(HSYA)對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)損傷神經(jīng)元PPARγ的表達(dá)及活性的研究，并進(jìn)一步研究羥基紅花黃色素A對(duì)PPARγ活性的影響機(jī)制，為羥基紅花黃素素A防治谷氨酸神經(jīng)損傷提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　以體外原代培養(yǎng)的SpragueDawley雌性大鼠(孕17-20d)大腦皮層神經(jīng)元作為實(shí)驗(yàn)材料，體外培養(yǎng)7天后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
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2、、細(xì)胞形態(tài)觀察：于倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，并采集各組細(xì)胞形態(tài)的圖像。
　　2、免疫熒光染色法(MAP2)對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元進(jìn)行純度鑒定。
　　3、MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　4、Westernblot法檢測(cè)不同組別細(xì)胞內(nèi)PPARγ、p-PPARγ、p-MAPK的表達(dá)水平，并對(duì)PPARγ的胞漿蛋白和胞核蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　5、免疫熒光染色法對(duì)不同組別細(xì)胞內(nèi)PPARγ，p-PPARγ、p-MAPK的

3、表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位進(jìn)行檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、細(xì)胞形態(tài)觀察：
　　正常神經(jīng)元經(jīng)體外培養(yǎng)第7天時(shí)形態(tài)飽滿(mǎn)，突起豐富，相互交織成網(wǎng)絡(luò)。不同濃度谷氨酸可使大部分神經(jīng)元腫脹變圓，細(xì)胞突起變短或消失，胞體立體感差，并可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片。HSYA保護(hù)組神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞腫脹減少，且細(xì)胞立體感較好，細(xì)胞突起基本存在。
　　2、MTT法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)存活率：
　　不同濃度谷氨酸處理組神經(jīng)元活性降低。HSYA保護(hù)

4、組對(duì)谷氨酸損傷神經(jīng)元有不同程度的保護(hù)作用，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　3、Westernblot印跡法顯示：
　　(1)用不同濃度谷氨酸處理以后，與正常對(duì)照組相比，PPARγ蛋白水平表達(dá)降低，p-PPARγ蛋白表達(dá)量增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同時(shí)加入不同濃度HSYA處理，與谷氨酸處理模型組相比，結(jié)果顯示HSYA對(duì)PPARγ表達(dá)無(wú)明顯改變。但可降低胞漿PPARγ蛋白的表達(dá)水平，而增加胞核PPARγ(PPA

5、Rγ的活性形式)蛋白的表達(dá)水平，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。同時(shí)HSYA可以顯著降低p-PPARγ蛋白表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　(2)用谷氨酸不同濃度、不同時(shí)程處理以后，與正常對(duì)照組相比，谷氨酸8h組無(wú)明顯改變(P>0.05)，其余組p-MAPK蛋白表達(dá)量增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　(3)加入MAPK的上游激酶MEK的抑制劑U0126作用于谷氨酸損傷神經(jīng)元，與谷氨酸損傷組相比，U

6、0126組可以顯著降低p-MAPK蛋白表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　(4)加入不同濃度HSYA處理率谷氨酸損傷神經(jīng)元，與谷氨酸處理組相比，結(jié)果顯示HSYA可顯著降低p-MAPK、p-PPARγ表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(均P<0.05)。
　　4、免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞定位及表達(dá)水平
　　(1)PPARγ：正常對(duì)照組神經(jīng)元PPARγ在胞漿、胞核均有表達(dá)，以胞核為主，谷氨酸損傷組PPARγ表達(dá)水平

7、下降，以胞核明顯。HSYA保護(hù)組PPARγ陽(yáng)性染色無(wú)明顯改變，PPARγ胞漿染色降低，而胞核染色增加。
　　(2)p-PPARγ：正常對(duì)照組神經(jīng)元p-PPARγ在胞漿，胞核表達(dá)均有表達(dá)，以胞漿表達(dá)為多；谷氨酸損傷組p-PPARγ表達(dá)顯著增加；HSYA保護(hù)組可降低p-PPARγ表達(dá)。
　　(3)p-MAPK：正常對(duì)照組神經(jīng)元p-MAPK陽(yáng)性細(xì)胞較少；谷氨酸損傷組p-MAPK表達(dá)增加，且主要以胞核表達(dá)為主。HSYA保護(hù)組p-MA

8、PK陽(yáng)性染色表達(dá)下降。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1、在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，HSYA可抑制谷氨酸對(duì)體外培養(yǎng)神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用，提高細(xì)胞存活率。
　　2、在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，谷氨酸降低PPARγ總蛋白表達(dá)水平，增加p-PPARγ蛋白表達(dá)水平。而HSYA對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的PPARγ總蛋白改變無(wú)明顯影響，但可提高PPARγ核蛋白表達(dá)，同時(shí)降低p-PPARγ水平，即HSYA阻斷谷氨酸誘導(dǎo)的PPARγ活性抑制。
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9、在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，谷氨酸可激活MAPK，MAPK抑制劑可減少谷氨酸對(duì)MAPK的激活作用，同時(shí)降低谷氨酸誘導(dǎo)的p-PPARγ，提示MAPK介導(dǎo)了谷氨酸對(duì)PPARγ的磷酸化。
　　4、在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中，HSYA可抑制谷氨酸誘導(dǎo)的MAPK活化以及PPARγ，的磷酸化，提示HSYA可能通過(guò)抑制MAPK，從而降低了谷氨酸誘導(dǎo)的PPARγ磷酸化。
　　5、在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中，HSYA可能(至少部分)通過(guò)阻斷谷氨酸對(duì)PPAR