羥基紅花黃色素A對谷氨酸損傷神經(jīng)元PPARγ的表達和活性的影響.pdf

1、研究目的：
　　1、探討谷氨酸誘導神經(jīng)元損傷的機制；
　　2、探討羥基紅花黃色素A(HSYA)對谷氨酸誘導損傷神經(jīng)元PPARγ的表達及活性的研究，并進一步研究羥基紅花黃色素A對PPARγ活性的影響機制，為羥基紅花黃素素A防治谷氨酸神經(jīng)損傷提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　實驗方法：
　　以體外原代培養(yǎng)的SpragueDawley雌性大鼠(孕17-20d)大腦皮層神經(jīng)元作為實驗材料，體外培養(yǎng)7天后，進行實驗。
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2、、細胞形態(tài)觀察：于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)，并采集各組細胞形態(tài)的圖像。
　　2、免疫熒光染色法(MAP2)對體外培養(yǎng)的神經(jīng)元進行純度鑒定。
　　3、MTT比色法檢測細胞活性。
　　4、Westernblot法檢測不同組別細胞內(nèi)PPARγ、p-PPARγ、p-MAPK的表達水平，并對PPARγ的胞漿蛋白和胞核蛋白水平進行檢測。
　　5、免疫熒光染色法對不同組別細胞內(nèi)PPARγ，p-PPARγ、p-MAPK的

3、表達水平和亞細胞定位進行檢測。
　　實驗結(jié)果：
　　1、細胞形態(tài)觀察：
　　正常神經(jīng)元經(jīng)體外培養(yǎng)第7天時形態(tài)飽滿，突起豐富，相互交織成網(wǎng)絡(luò)。不同濃度谷氨酸可使大部分神經(jīng)元腫脹變圓，細胞突起變短或消失，胞體立體感差，并可見大量細胞碎片。HSYA保護組神經(jīng)元生長狀態(tài)良好，細胞腫脹減少，且細胞立體感較好，細胞突起基本存在。
　　2、MTT法測定細胞相對存活率：
　　不同濃度谷氨酸處理組神經(jīng)元活性降低。HSYA保護

4、組對谷氨酸損傷神經(jīng)元有不同程度的保護作用，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　3、Westernblot印跡法顯示：
　　(1)用不同濃度谷氨酸處理以后，與正常對照組相比，PPARγ蛋白水平表達降低，p-PPARγ蛋白表達量增加，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。同時加入不同濃度HSYA處理，與谷氨酸處理模型組相比，結(jié)果顯示HSYA對PPARγ表達無明顯改變。但可降低胞漿PPARγ蛋白的表達水平，而增加胞核PPARγ(PPA

5、Rγ的活性形式)蛋白的表達水平，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。同時HSYA可以顯著降低p-PPARγ蛋白表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　(2)用谷氨酸不同濃度、不同時程處理以后，與正常對照組相比，谷氨酸8h組無明顯改變(P>0.05)，其余組p-MAPK蛋白表達量增加，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　(3)加入MAPK的上游激酶MEK的抑制劑U0126作用于谷氨酸損傷神經(jīng)元，與谷氨酸損傷組相比，U

6、0126組可以顯著降低p-MAPK蛋白表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　(4)加入不同濃度HSYA處理率谷氨酸損傷神經(jīng)元，與谷氨酸處理組相比，結(jié)果顯示HSYA可顯著降低p-MAPK、p-PPARγ表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義。(均P<0.05)。
　　4、免疫熒光方法檢測細胞定位及表達水平
　　(1)PPARγ：正常對照組神經(jīng)元PPARγ在胞漿、胞核均有表達，以胞核為主，谷氨酸損傷組PPARγ表達水平

7、下降，以胞核明顯。HSYA保護組PPARγ陽性染色無明顯改變，PPARγ胞漿染色降低，而胞核染色增加。
　　(2)p-PPARγ：正常對照組神經(jīng)元p-PPARγ在胞漿，胞核表達均有表達，以胞漿表達為多；谷氨酸損傷組p-PPARγ表達顯著增加；HSYA保護組可降低p-PPARγ表達。
　　(3)p-MAPK：正常對照組神經(jīng)元p-MAPK陽性細胞較少；谷氨酸損傷組p-MAPK表達增加，且主要以胞核表達為主。HSYA保護組p-MA

8、PK陽性染色表達下降。
　　實驗結(jié)論：
　　1、在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，HSYA可抑制谷氨酸對體外培養(yǎng)神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用，提高細胞存活率。
　　2、在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，谷氨酸降低PPARγ總蛋白表達水平，增加p-PPARγ蛋白表達水平。而HSYA對谷氨酸誘導的PPARγ總蛋白改變無明顯影響，但可提高PPARγ核蛋白表達，同時降低p-PPARγ水平，即HSYA阻斷谷氨酸誘導的PPARγ活性抑制。
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9、在原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中，谷氨酸可激活MAPK，MAPK抑制劑可減少谷氨酸對MAPK的激活作用，同時降低谷氨酸誘導的p-PPARγ，提示MAPK介導了谷氨酸對PPARγ的磷酸化。
　　4、在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中，HSYA可抑制谷氨酸誘導的MAPK活化以及PPARγ，的磷酸化，提示HSYA可能通過抑制MAPK，從而降低了谷氨酸誘導的PPARγ磷酸化。
　　5、在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中，HSYA可能(至少部分)通過阻斷谷氨酸對PPAR