微流控免疫芯片在病原菌快速檢測中的研究.pdf

1、病原菌的常規(guī)檢測包括非選擇性和選擇性培養(yǎng)、生化反應和血清學鑒定等步驟,其操作繁瑣,周期長(5-7d),費時費力,不能滿足當代社會對環(huán)境、食品安全監(jiān)督和傳染性疾病快速診斷的需要。近年來,隨著生物技術的發(fā)展而建立起來的快速檢測技術(如免疫分析技術、PCR技術等)雖然能夠在較短時間內鑒定病原菌,但仍存在如靈敏度較低、假陽性和假陰性率高、操作復雜、成本昂貴等缺陷,因此發(fā)展能夠準確、敏感、快速地檢測病原菌的技術方法刻不容緩。
　　 微流控

2、芯片作為新出現的微分析技術平臺,以其結構縮微化、功能集成化、樣品和試劑耗量低、高通量輸出、分析時間短、易于便攜和自動化等優(yōu)勢,近年來在微生物檢測中的發(fā)展非常迅速。但現有的微流控芯片微生物檢測的研究主要是針對微生物研究中的某一單元或步驟,如富集/分選、預處理或分離檢測展開的,缺乏集樣品處理、稀少樣本富集/分選和檢測于一體的整合技術或方法,整個研究也處于起步階段。而如何將病原菌檢測各個環(huán)節(jié)的操作過程集成于一張微流控芯片上,并形成自動化的病原

3、菌檢測系統(tǒng),是當今微流控芯片用于病原菌檢測所面臨的挑戰(zhàn)。
　　 鑒于當今社會對病原菌快速檢測的要求和現有檢測技術的缺陷,本研究構建了一個微流控免疫分析芯片,在芯片上開展了病原菌的分選/富集和生物發(fā)光檢測研究。微流控芯片免疫分選技術具有抗體和試劑耗量低、反應速度快、易于集成和實現自動化的優(yōu)勢:而以具有納米至微米級尺寸粒徑的微珠作為抗體的固相載體,不但可以增大抗原-抗體反應的比表面積,而且其易于填充和更換的特點可以使芯片各單元功能更

4、加分明,另外芯片構型簡單、價格低廉,易于構建和普及。利用ATP-螢火蟲熒光素-蟲熒光素酶體系的生物發(fā)光分析對微生物進行定量,可因光子產生率高而達到極高的靈敏度,不需光源和復雜的光路,也無需對微生物進行標記,即可得到微生物數量和活性的信息,是可集成于微流控芯片上的理想檢測方法。
　　 因此,本研究以E.coli O157:H7為檢測目標,將針對該細菌的高特異性和高捕獲率的免疫微珠富集腔設計于芯片微通道中,并采用ATP生物發(fā)光體系對

5、富集到的細菌進行在線定量分析,建立了集高特異性捕獲/富集和高靈敏度檢測為一體的病原菌快速檢測法。
　　 研究首先根據實驗目的,設計PDMS/玻璃微流控芯片的微通道構型和尺寸,芯片包括流體傳輸、免疫捕獲和發(fā)光檢測三個功能性區(qū)域。通過模塑法完成了芯片的制作,并對制作工藝和封接方式進行了優(yōu)化。
　　 其次,通過對粒徑為50μm的玻璃微珠表面進行硅烷化處理和抗E.coli O157:H7多克隆抗體的共價連接,完成了玻璃微珠的生物

6、功能化修飾。將玻璃微珠填充于芯片微通道的六邊形腔內,通過探索微珠傳輸流速和方式,構建了一個呈單層均勻排列的芯片免疫微珠富集腔。并在熒光顯微鏡下觀察經吖啶橙染色的Ecoli O157:H7在芯片內的捕獲,進而驗證了免疫富集腔能夠有效捕獲/富集到細菌。利用平板培養(yǎng)計數法評價了芯片免疫富集腔的捕獲效率,通過對芯片進樣和沖洗的參數的優(yōu)化,使填充有免疫玻璃微珠的免疫富集腔對細菌樣品的實際捕獲率達到91.75％～95.62％。
　　 最后,

7、通過ATP-螢火蟲熒光素.蟲熒光素酶體系和微弱發(fā)光檢測儀實現了對芯片內捕獲到的細菌的生物發(fā)光檢測,并對芯片內發(fā)光反應的各種條件進行了優(yōu)化。通過細菌濃度-發(fā)光強度回歸方程的擬合,建立了用生物發(fā)光反應的發(fā)光強度對細菌進行定量的方法。對方法的線性范圍、可靠性、重現性、穩(wěn)定性和特異性進行評價,證明了該微流控芯片病原菌檢測系統(tǒng)特異性高,并能對豬肉樣品中的E.coli O157:H7進行準確定量。
　　 綜上所述,本研究建立了一個特異性好、