米諾環(huán)素對腎缺血再灌注損傷的保護作用及其對TLRs信號途徑的影響研究.pdf

1、目的：1．觀察缺血再灌注后腎組織病理學(xué)改變、超微結(jié)構(gòu)變化及腎功能變化。 2．觀察缺血再灌注后腎組織中性粒細(xì)胞活化情況，探討中性粒細(xì)胞活化對腎缺血再灌注損傷的影響。 3．研究缺血再灌注后TLRs信號途徑中HSP70蛋白、TLR4蛋白、NF-κp50蛋白和TLR4mRNA的表達情況及相互關(guān)系，探討TLRs信號途徑致中性粒細(xì)胞活化的作用機制。 4．觀察米諾環(huán)素對缺血再灌注后腎組織病理學(xué)改變、超微結(jié)構(gòu)變化、腎

2、功能變化和腎組織中性粒細(xì)胞活化的影響。 5．觀察米諾環(huán)素對缺血再灌注后HSP70蛋白、TLR4蛋白、NF-κBp50蛋白和TLR4mRNA表達水平的影響并探討其對腎缺血再灌注損傷的保護作用機制。 方法：72只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分成3個實驗組：對照組(Control組)、缺血再灌注組(Ir組)、米諾環(huán)素組(M組)，每組24只動物，每組按取材時間不同分為4個時相組(6H、12H、24H、72

3、H)，每個時相組6只動物。對結(jié)果進行單向方差分析和Pearson相關(guān)性分析。 結(jié)果： 1．光鏡下，對照組腎組織形態(tài)學(xué)觀察未見明顯異常；缺血再灌注組腎小管上皮細(xì)胞可見不同程度的渾濁腫脹、凝固性壞死，間質(zhì)充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤，組織損傷以24H最重；米諾環(huán)素組腎小管上皮細(xì)胞水樣變性、氣球樣變性輕微，未見明顯壞死，間質(zhì)無明顯充血、水腫，僅少許炎細(xì)胞浸潤，組織病理學(xué)改變明顯輕于缺血再灌注組。 2．透射電鏡下，對照組腎組織

4、超微結(jié)構(gòu)觀察未見明顯異常；缺血再灌注組濾過膜厚薄不均，近曲小管上皮細(xì)胞水腫，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，核腫脹、染色質(zhì)邊集、不規(guī)則變形甚至溶解，間質(zhì)中血管淤血；米諾環(huán)素組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)輕度空泡變性，局部可見線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，超微結(jié)構(gòu)損害明顯輕于缺血再灌注組。 3．對照組中，Scr維持在較低水平(6H：40.33±8.76，12H：42.50±7.42，24H：40.67±6.35，72H：38.83±3.54)；缺

5、血再灌注組中，再灌注后6HScr水平明顯升高(106.33±12.74)，12H繼續(xù)升高(165.33±19.19)，24H達到峰值(201.33±21.52)，72H下降到谷值，但仍維持較高水平(90.17±15.87)，與對照組比較差異具有顯著性意義(P<0.01)；米諾環(huán)素組中，Scr水平明顯低于缺血再灌注組(6H：61.50±11.50，12H：87.50±14.18，24H：113.83±17.21，72H：56.00±13.

6、76)(P<0.01)，但仍高于對照組(P<0.05)。 4．對照組中，腎組織MPO活性維持在較低水平(6H：0.331±0.067，12H：0.329±0.045，24H：0.327±0.053，72H：0.321±0.058)；缺血再灌注組中，再灌注后6H腎組織MPO活性明顯增強(0.539±0.081)，12H繼續(xù)增強(0.646±0.092)，24H達到峰值(0.767±0.102)，72H下降到谷值，但仍維持較高水平(

7、0.528±0.072)，與對照組比較差異具有顯著性意義(P<0.01)；米諾環(huán)素組中，腎組織MPO活性明顯低于缺血再灌注組(6H：0.431±0.075，12H：0.507±0.076，24H：0.612±0.081，72H：0.415±0.093)(P<0.05)，但6H、12H、24 H仍高于對照組(6H，P<0.05；12H、24H，P<0.01)，72H二者無明顯差異(P>0.05)。 5．對照組中HSP70蛋白低表達

8、(6H：5.63±3.31，12H：8.02±4.69，24H：6.57±2.83，72H:5.98±2.68)；缺血再灌注組中HSP70蛋白表達于再灌注后6H明顯增強(215.37±60.34)，12H達到峰值(264.15±51.64)，24H有所減弱(209.83±72.83)，72H繼續(xù)下降達谷值，但仍維持較高水平(70.35±16.92)，與對照組比較差異具有顯著性意義(P<0.01)；米諾環(huán)素組HSP70蛋白表達明顯減弱(6

9、H：131.70±33.29， 12H： 159.63±42.57，24H： 142.73±43.19，72H：46.83±21.73)，與缺血再灌注組比較差異具有顯著性意義(6H、12H，P<0.01；24H、72H，P<0.05)，但仍高于對照組(P<0.01)。 6．對照組中TLR4蛋白幾乎無表達(6H：0.88±0.40，12H：1.00±0.33，24H：1.17±0.61，72H：1.00±0.29)；缺血再灌注組中

10、TLR4蛋白表達于再灌注后6H明顯增強(88.28±25.28)，12H繼續(xù)增強(142.45±27.59)，24H達到峰值(185.95±27.38)，72H下降到谷值，但仍維持較高水平(50.02±12.00)，與對照組比較差異具有顯著性意義(P<0.01)；米諾環(huán)素組12H、24HTLR4蛋白表達明顯減弱(6H：88.81±18.26，12H：92.70±21.75，24H：107.68±24.43，72H：46.77±11.66

11、)，與缺血再灌注組同一時相比較差異具有顯著性意義(P<0.01)，6H、72H二者無明顯差異(P>0.05)，但各時相表達仍高于對照組(P<0.01)。 7．對照組中NF-κBp50蛋白幾乎無表達(6H:1.17±0.56，12H:1.25±0.65，24H: 1.30±0.66，72H:1.23±0.83)；缺血再灌注組中NF-κBp50蛋白表達于再灌注后6H明顯增強(79.45±15.72)，12H繼續(xù)增強(132.77±3

12、5.39)，24H達到峰值(180.42±42.49)，72H下降到谷值，但仍維持較高水平(43.35±12.31)，與對照組比較差異具有顯著性意義(P<0.01)；米諾環(huán)素組12H、24HNF-κBp50蛋白表達明顯減弱(6H：72.82±16.32，12H：97.42±25.34，24H：100.73±20.09，72H：45.27±13.20)，與缺血再灌注組同一時相比較差異具有顯著性意義(12H，P<0.05；24H，P<0.0

13、1)，6H、72H二者無明顯差異(P>0.05)，但各時相表達仍高于對照組(P<0.01)。 8．對照組中TLR4mRNA低表達(6H：40.45±17.05，12H：41.18±12.51，24H：43.10±14.23，72H：44.65±14.35)；缺血再灌注組中TLR4mRNA表達于再灌注后6H明顯增強(124.30±19.92)，12H繼續(xù)增強(188.48±35.43)，24H達到峰值(288.23±40.97)，

14、72H下降到谷值，但仍維持較高水平(79.83±11.07)，與對照組比較差異具有顯著性意義(P<0.01)；米諾環(huán)素組12H、24HTLR4mRNA表達明顯減弱(6H：110.45±19.43，12H：145.85±20.44，24H：187.03±27.30，72H：77.73±12.85)，與缺血再灌注組同一時相比較差異具有顯著性意義(12H，P<0.05；24H，P<0.01)，6H、72H二者無明顯差異(P>0.05)，但各時

15、相表達仍高于對照組(P<0.01)。 9．在缺血再灌注組中，TLR4mRNA表達水平與TLR4蛋白表達水平呈顯著性正相關(guān)關(guān)系(r=0.873，P<0.01)。 10．在缺血再灌注組中，HSP70蛋白表達水平與TLR4蛋白和NF-κ Bp50蛋白表達水平呈顯著性正相關(guān)關(guān)系(r=0.602，P<0.01；r=0.542，P<0.01)；TLR4蛋白表達水平與NF-κBp50蛋白表達水平呈顯著性正相關(guān)關(guān)系(r=0.865，P<

16、0.01)。 11．在缺血再灌注組中，HSP70蛋白表達水平與Scr水平呈顯著性正相關(guān)關(guān)系(r=0.529，P<0.01)，與MPO活性無相關(guān)關(guān)系；TLR4蛋白表達水平與Scr水平和MPO活性呈顯著性正相關(guān)關(guān)系(r=0.828，P<0.01；r=0.684，P<0.01)；NF-κBp50蛋白表達水平與Scr水平和MPO活性呈顯著性正相關(guān)關(guān)系(r=0.836，P<0.01；r=0.655，P<0.01)。 12．在缺血再

17、灌注組中，MPO活性與Scr水平呈顯著性正相關(guān)關(guān)系(r=0.652，P<0.01)。 結(jié)論： 1．腎缺血45Min可導(dǎo)致缺血再灌注損傷的發(fā)生，出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的損傷和破壞，腎功能顯著下降。 2．缺血再灌注后腎組織中性粒細(xì)胞活化明顯增強，對腎功能損害具有促進作用。 3．缺血再灌注后HSP70蛋白、TLR4蛋白、NF-κ Bp50蛋白和TLR4mRNA的表達上調(diào)，缺血再灌注激活了TLRs信號途