米諾環(huán)素對(duì)缺血再灌注腦損傷后軸突再生的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：腦卒中是目前世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，其發(fā)病率隨著年齡的增加而上升，對(duì)家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腦卒中患者殘留嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損，是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生困難。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為，中樞神經(jīng)再生困難最主要的原因是因?yàn)槭軗p神經(jīng)元缺乏內(nèi)源性再生的能力。但目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)病灶周圍存在大量軸突再生抑制因子，這是阻礙受損神經(jīng)元軸突再生的關(guān)鍵因素。排斥性導(dǎo)向分子(repulsive guidance molecu

2、le A，RGMa)是目前認(rèn)為最有潛力的軸突再生抑制因子之一，可以激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子RhoA及其效應(yīng)器ROCK，使下游底物肌球蛋白輕鏈(myosin light chains，MLC)磷酸化水平增加，從而介導(dǎo)生長(zhǎng)錐的塌陷和軸突再生抑制作用。米諾環(huán)素是一種能通過(guò)血腦屏障的四環(huán)素類抗生素，在多種急性腦缺血的動(dòng)物模型中具有廣譜的抗炎、抗凋亡、抗氧化及血管保護(hù)作用。在前期的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素可促進(jìn)急性腦梗死患者神經(jīng)功能的恢復(fù)。然而，

3、其潛在的細(xì)胞和分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究擬觀察米諾環(huán)素是否可以通過(guò)下調(diào)缺血灶周圍RGMa的表達(dá)，促進(jìn)軸突再生，從而改善大鼠的神經(jīng)功能，并且在體外進(jìn)一步觀察米諾環(huán)素是否通過(guò)MLCP/MLC信號(hào)通路促進(jìn)氧糖剝奪/復(fù)氧損傷后PC12細(xì)胞神經(jīng)突的生長(zhǎng)作用。
　　方法：
　　第一部分
　　1.將72只清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為以下四組:假手術(shù)組，缺血再灌注組，生理鹽水組及米諾環(huán)素組，各組各18只。采用線栓法

4、閉塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈2h制備局灶性腦缺血再灌注損傷(I/R)模型，于再灌注的同時(shí)靜脈注射3mg/kg的米諾環(huán)素，每天2次，持續(xù)14天。在缺血再灌注24 h后，采用伊文思藍(lán)(EB)法檢測(cè)缺血腦組織血腦屏障通透性的改變。
　　2.再灌注2周時(shí)，采用免疫組織化學(xué)及Western Blot法檢測(cè)缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬中RGMa蛋白的表達(dá)，免疫組化染色神經(jīng)微絲蛋白200(NF-200)評(píng)估神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)。
　　3.分別在缺血再灌注第2，

5、7，14及28天，采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分(Modified neurological severity scores，mNSS)）及Montoya樓梯實(shí)驗(yàn)(staircase test)評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能。
　　第二部分
　　1.采用氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷，體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞隨機(jī)分為正常組，氧糖剝奪2，4，

6、6，8h組和不同濃度的（0.1，1，10μM）米諾環(huán)素治療組。在氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧24 h后采用CCK-8法測(cè)定PC12細(xì)胞的存活率。
　　2.在氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧24 h后采用MAP-2免疫細(xì)胞熒光染色標(biāo)記PC12細(xì)胞的神經(jīng)突，熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)突長(zhǎng)度，Western blot法檢測(cè)各組GAP-43蛋白的表達(dá)水平。
　　3.體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞隨機(jī)分為正常組，模型組，1μM米諾環(huán)素組和MLCP抑制劑組(1 nM，Calycul

7、in A)。在氧糖剝奪再?gòu)?fù)氧24 h后采用Western blot法測(cè)定MLC及p-MLC的表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)突的長(zhǎng)度及檢測(cè)GAP-43蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.缺血再灌注24 h后，大鼠缺血側(cè)腦組織有明顯的EB滲出(4.40±0.73μg/g)，靜脈給予3 mg/kg米諾環(huán)素治療后能降低缺血側(cè)腦組織EB的滲出量（2.71±0.68μg/g，P＜0.05）。
　　2.缺血再灌注2

8、周后，缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬RGMa蛋白表達(dá)增加，軸突損傷嚴(yán)重，NF-200蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，而米諾環(huán)素組大鼠缺血腦組織內(nèi)RGMa表達(dá)較模型組明顯降低(P＜0.05)，NF-200蛋白表達(dá)±曾加(P＜0.05)。
　　3.米諾環(huán)素使大鼠缺血再灌注損傷后改良的神經(jīng)功能評(píng)分(mNSS)顯著下降并改善大鼠的前肢運(yùn)動(dòng)功能(P＜0.05)。
　　第二部分
　　1.PC12細(xì)胞的存活率隨缺氧缺糖時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，OG

9、D6h時(shí)細(xì)胞存活率為(46.1±2.9)。（0.1～10μM）米諾環(huán)素呈非線性濃度依賴性提高氧糖剝奪6h后PC12細(xì)胞的存活率，其中1μM濃度作用最強(qiáng)(P＜0.05)。
　　2.氧糖剝奪損傷引起PC12細(xì)胞神經(jīng)突回縮，米諾環(huán)素能顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞氧糖剝奪損傷后神經(jīng)突的生長(zhǎng)，同時(shí)上調(diào)軸突再生蛋白GAP-43的表達(dá)(P＜0.05)，Calyculin A能阻斷米諾環(huán)素的促進(jìn)作用。此外，氧糖剝奪誘導(dǎo)PC12細(xì)胞MLC磷酸化水平增加，而