米諾環(huán)素對缺血再灌注腦損傷后軸突再生的影響及機制研究.pdf

1、目的：腦卒中是目前世界范圍內(nèi)嚴重危害人類健康的疾病之一，其發(fā)病率隨著年齡的增加而上升，對家庭和社會造成嚴重的經(jīng)濟負擔。腦卒中患者殘留嚴重的神經(jīng)功能缺損，是因為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后軸突再生困難。傳統(tǒng)的觀點認為，中樞神經(jīng)再生困難最主要的原因是因為受損神經(jīng)元缺乏內(nèi)源性再生的能力。但目前的觀點認為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)病灶周圍存在大量軸突再生抑制因子，這是阻礙受損神經(jīng)元軸突再生的關鍵因素。排斥性導向分子(repulsive guidance molecu

2、le A，RGMa)是目前認為最有潛力的軸突再生抑制因子之一，可以激活細胞內(nèi)信號傳導分子RhoA及其效應器ROCK，使下游底物肌球蛋白輕鏈(myosin light chains，MLC)磷酸化水平增加，從而介導生長錐的塌陷和軸突再生抑制作用。米諾環(huán)素是一種能通過血腦屏障的四環(huán)素類抗生素，在多種急性腦缺血的動物模型中具有廣譜的抗炎、抗凋亡、抗氧化及血管保護作用。在前期的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素可促進急性腦梗死患者神經(jīng)功能的恢復。然而，

3、其潛在的細胞和分子機制尚未完全闡明。本研究擬觀察米諾環(huán)素是否可以通過下調(diào)缺血灶周圍RGMa的表達，促進軸突再生，從而改善大鼠的神經(jīng)功能，并且在體外進一步觀察米諾環(huán)素是否通過MLCP/MLC信號通路促進氧糖剝奪/復氧損傷后PC12細胞神經(jīng)突的生長作用。
　　方法：
　　第一部分
　　1.將72只清潔級健康成年雄性SD大鼠，按隨機數(shù)字表法分為以下四組:假手術組，缺血再灌注組，生理鹽水組及米諾環(huán)素組，各組各18只。采用線栓法

4、閉塞大鼠右側(cè)大腦中動脈2h制備局灶性腦缺血再灌注損傷(I/R)模型，于再灌注的同時靜脈注射3mg/kg的米諾環(huán)素，每天2次，持續(xù)14天。在缺血再灌注24 h后，采用伊文思藍(EB)法檢測缺血腦組織血腦屏障通透性的改變。
　　2.再灌注2周時，采用免疫組織化學及Western Blot法檢測缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬中RGMa蛋白的表達，免疫組化染色神經(jīng)微絲蛋白200(NF-200)評估神經(jīng)元軸突的生長。
　　3.分別在缺血再灌注第2，

5、7，14及28天，采用改良的神經(jīng)功能缺損評分(Modified neurological severity scores，mNSS)）及Montoya樓梯實驗(staircase test)評估大鼠的神經(jīng)功能。
　　第二部分
　　1.采用氧糖剝奪/復氧(oxygen glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷，體外培養(yǎng)的PC12細胞隨機分為正常組，氧糖剝奪2，4，

6、6，8h組和不同濃度的（0.1，1，10μM）米諾環(huán)素治療組。在氧糖剝奪再復氧24 h后采用CCK-8法測定PC12細胞的存活率。
　　2.在氧糖剝奪再復氧24 h后采用MAP-2免疫細胞熒光染色標記PC12細胞的神經(jīng)突，熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)突長度，Western blot法檢測各組GAP-43蛋白的表達水平。
　　3.體外培養(yǎng)的PC12細胞隨機分為正常組，模型組，1μM米諾環(huán)素組和MLCP抑制劑組(1 nM，Calycul

7、in A)。在氧糖剝奪再復氧24 h后采用Western blot法測定MLC及p-MLC的表達，熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)突的長度及檢測GAP-43蛋白的表達水平。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.缺血再灌注24 h后，大鼠缺血側(cè)腦組織有明顯的EB滲出(4.40±0.73μg/g)，靜脈給予3 mg/kg米諾環(huán)素治療后能降低缺血側(cè)腦組織EB的滲出量（2.71±0.68μg/g，P＜0.05）。
　　2.缺血再灌注2

8、周后，缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬RGMa蛋白表達增加，軸突損傷嚴重，NF-200蛋白表達明顯降低(P＜0.05)，而米諾環(huán)素組大鼠缺血腦組織內(nèi)RGMa表達較模型組明顯降低(P＜0.05)，NF-200蛋白表達±曾加(P＜0.05)。
　　3.米諾環(huán)素使大鼠缺血再灌注損傷后改良的神經(jīng)功能評分(mNSS)顯著下降并改善大鼠的前肢運動功能(P＜0.05)。
　　第二部分
　　1.PC12細胞的存活率隨缺氧缺糖時間的延長而逐漸降低，OG

9、D6h時細胞存活率為(46.1±2.9)。（0.1～10μM）米諾環(huán)素呈非線性濃度依賴性提高氧糖剝奪6h后PC12細胞的存活率，其中1μM濃度作用最強(P＜0.05)。
　　2.氧糖剝奪損傷引起PC12細胞神經(jīng)突回縮，米諾環(huán)素能顯著促進PC12細胞氧糖剝奪損傷后神經(jīng)突的生長，同時上調(diào)軸突再生蛋白GAP-43的表達(P＜0.05)，Calyculin A能阻斷米諾環(huán)素的促進作用。此外，氧糖剝奪誘導PC12細胞MLC磷酸化水平增加，而