BCL-2蛋白高表達(dá)PC12細(xì)胞系的建立及其對(duì)酒精誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)的研究.pdf

1、目的:克隆小鼠BCL-2基因全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-bcl-2，并建立高表達(dá)BCL-2蛋白的PC12細(xì)胞，為研究BCL-2蛋白在酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡中的作用提供依據(jù)。
　　 方法:從小鼠脾臟中提取總RNA，采用RT-PCR方法克隆BCL-2的cDNA，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物并回收BCL-2基因。將全長(zhǎng)BCL-2基因與pMD-19T載體連接，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、克隆、轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及菌液

2、DNA測(cè)序鑒定，檢測(cè)BCL-2基因的準(zhǔn)確性并檢測(cè)是否成功重組質(zhì)粒pMD19-T-bcl-2。用HindⅢ和EcoRⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒pcDNA3.1(-)和重組質(zhì)粒pMD19-T-bcl-2DNA進(jìn)行酶切，切割產(chǎn)物經(jīng)1％的DNA瓊脂糖凝膠電泳分離后，用T4DNA連接酶將所需片段連接，轉(zhuǎn)化、克隆、提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA，雙酶切鑒定確定真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-bcl-2是否構(gòu)建成功。采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至PC1

3、2細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，分別從PC12細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(-)的PC12細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了真核表達(dá)載體的PC12細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR的方法檢測(cè)細(xì)胞BCL-2基因mRNA的表達(dá)，應(yīng)用Western-blot的方法檢測(cè)BCL-2蛋白的表達(dá)。MTT法測(cè)定不同濃度酒精(100mmoL/L、200mmoL/L、400mmoL/L)對(duì)三種PC12細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果:從小鼠脾臟獲得較純的RNA，RT-PCR

4、方法獲得到BCL-2基因產(chǎn)物。BCL-2基因和pMD-19T載體連接后，經(jīng)PCR和菌液測(cè)序證實(shí)，BCL-2基因正確且已和pMD-19T載體成功連接，得到重組質(zhì)粒pMD19-T-bcl-2。雙酶切質(zhì)粒pMD19-T-bcl-2和peDNA3.1(-)DNA并經(jīng)T4DNA連接酶連接所需片段后，構(gòu)建出真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)-bcl-2。從3種不同的PC12細(xì)胞得到純度較高的RNA，經(jīng)RT-PCR和Western-blot分別檢測(cè)B

5、CL-2mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示成功建立了高表達(dá)BCL-2蛋白的PC12細(xì)胞系。MTT結(jié)果表明，100mmol/L和200mmol/L酒精濃度時(shí)，BCL-2高表達(dá)的PC12細(xì)胞組的生存率顯著高于對(duì)照組(P<0.01，P<0.05)，酒精濃度為400mmol/L時(shí)，兩組生存率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BCL-2蛋白在酒精濃度為100～200mmol/L范圍內(nèi)，對(duì)酒精誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的損傷及凋亡的有保護(hù)作用。