染料木素通過JNK調(diào)控Fas和Bcl-2家族抑制Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、染料木素（genistein，Gen）是大豆異黃酮的主要活性成份。Gen作為植物雌激素，與雌激素相比，在發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的同時沒有對非神經(jīng)細(xì)胞的致癌等副作用。Gen的神經(jīng)保護(hù)作用受到持續(xù)關(guān)注。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，Gen可增強(qiáng)PKC的活性，調(diào)節(jié)α-/β-分泌酶活性，減少不溶性Aβ沉積，并逆轉(zhuǎn)Aβ誘導(dǎo)的Bcl-2的下調(diào)和Bax的上調(diào)，降低細(xì)胞的凋亡程度，最終顯著提高Aβ刺激的PC12細(xì)胞的活力。目前，有關(guān) Gen的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制逐漸深

2、入，但其分子保護(hù)機(jī)制及其相關(guān)的信號仍有待進(jìn)一步闡明。本論文繼續(xù)探討Gen體外水平的抗Aβ神經(jīng)保護(hù)機(jī)制及其分子機(jī)制。具體內(nèi)容如下：
　　1. Gen對Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的細(xì)胞活力、凋亡染色、凋亡率的研究：MTT細(xì)胞活力測定結(jié)果顯示，0-25μM的Gen對細(xì)胞活力幾無影響，而50和100μM Gen使細(xì)胞存活率顯著降低，Aβ顯著降低PC12細(xì)胞存活率的最小劑量是20μM，0-100μM的Gen都顯著提高Aβ處理的PC12細(xì)胞存活

3、率，而25μM的Gen具有最大保護(hù)效應(yīng)；Hoechst33342凋亡染色結(jié)果表明，與對照組相比，Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞有明顯的凋亡細(xì)胞特征，其凋亡細(xì)胞比例顯著多于對照組，而Gen處理組（12.5、25、50和100μM）顯著減少凋亡細(xì)胞的比例；Annexin V-FITC雙染法檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，Aβ組顯著高于對照組，且Gen作用組（12.5、25、50和100μM）都顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但25μM劑量的Gen具有最大抑制效

4、應(yīng)。
　　2. qPCR和Western blot檢測Gen對Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Fas和FasL mRNA和蛋白表達(dá)的影響：qPCR結(jié)果顯示，Aβ誘導(dǎo)組顯著增加FasL的表達(dá)，溫和上調(diào)Fas的表達(dá)，Gen顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的Fas和FasL mRNA的增加；Westernblot結(jié)果顯示，Aβ組顯著增加Fas和FasL的表達(dá)，Gen顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的Fas和FasL蛋白水平的增加。
　　3. qPCR和Western blo

5、t檢測Gen對Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl-w和BimmRNA和蛋白表達(dá)的影響：qPCR結(jié)果顯示，Aβ組顯著減少Bcl-w和增加Bim的表達(dá)，Gen可逆轉(zhuǎn)Aβ誘導(dǎo)的Bcl-w和Bim的變化；Western blot結(jié)果與qPCR結(jié)果一致。
　　4.Western blot檢測Gen對Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞質(zhì)中Cyt C和Smac蛋白表達(dá)的影響：結(jié)果顯示，Gen可逆轉(zhuǎn)Aβ刺激引起Cyt C和Smac從線粒體到細(xì)胞質(zhì)的釋放。
　　5

6、. qPCR和分光光度法檢測Gen對Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8 mRNA和酶活力的影響：結(jié)果顯示，Gen可抑制Aβ誘導(dǎo)Caspase-3和Caspase-8 mRNA的增加；Caspase-3和Caspase-8酶活性測定進(jìn)一步證實了Gen對Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8的抑制作用。
　　6.采用JNK-siRNA和磷酸化抑制劑SP600125干擾JNK，檢測Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞

7、 Fas和FasL mRNA和蛋白表達(dá)的變化：結(jié)果表明，Gen、JNK-siRNA和SP600125均對Aβ刺激引起的Fas和FasL mRNA和蛋白水平表達(dá)有抑制作用，Gen與JNK-siRNA/SP600125合用效果最強(qiáng)。
　　7.采用JNK-siRNA和磷酸化抑制劑SP600125干擾JNK，檢測Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Bcl-w和Bim mRNA和蛋白表達(dá)的變化：結(jié)果表明，Gen、JNK-siRNA和SP600125均對Aβ

8、刺激引起的Bcl-w和Bim mRNA和蛋白水平表達(dá)有抑制作用，Gen與JNK-siRNA/SP600125合用效果最強(qiáng)。
　　8.采用JNK-siRNA和磷酸化抑制劑SP600125干擾JNK，檢測Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞質(zhì)中Cyt C和Smac蛋白表達(dá)的變化：結(jié)果表明，Gen、JNK-siRNA和SP600125均對Aβ刺激引起的Cyt C和Smac蛋白表達(dá)有抑制作用，Gen與JNK-siRNA/SP600125合用效果最強(qiáng)。

9、r>　　9.采用JNK-siRNA和磷酸化抑制劑SP600125干擾JNK，檢測Gen對Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Caspase-3和Caspase-8 mRNA和酶活力的影響：結(jié)果表明，Gen、JNK-siRNA和SP600125均對Aβ刺激引起的Caspase-3和Caspase-8 mRNA和酶活力有抑制作用，Gen與JNK-siRNA/SP600125合用效果最強(qiáng)。
　　10.Westernblot檢測Gen對Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)

10、胞p-JNK和JNK蛋白表達(dá)的影響：結(jié)果表明，Aβ顯著誘導(dǎo)PC12細(xì)胞p-JNK54和46 kDa條帶，而Gen可顯著減弱p-JNK54和46 kDa條帶，Gen+SP600125合用效果最強(qiáng)。
　　研究結(jié)果表明，JNK-siRNA和SP600125均對Aβ刺激引起Fas介導(dǎo)凋亡途徑和線粒體凋亡途徑有抑制作用，暗示JNK參與調(diào)節(jié)Aβ誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Fas介導(dǎo)的和線粒體起始的凋亡途徑，而Gen顯著抑制Aβ誘導(dǎo)的JNK磷酸化的結(jié)果表明