TNF-α誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及對(duì)bcl-2和bax mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，腦內(nèi)神經(jīng)炎癥與多種慢性神經(jīng)退行性疾病如帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)和多發(fā)性硬化(MS)等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)能減弱受損腦區(qū)的神經(jīng)元病變。
　　 腫瘤壞死因子α(TNF-α)在各種炎癥和免疫反應(yīng)中由多種細(xì)胞分泌的一類多向性細(xì)胞因子。其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)急慢性炎性或變性病如缺血性腦血管病，PD，老年癡呆，肌萎縮側(cè)索硬化及多發(fā)性硬化中表達(dá)升高。TNF-α合成過量會(huì)導(dǎo)

2、致神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)病理性凋亡。
　　 以往認(rèn)為TNF-α誘導(dǎo)凋亡的通路只有通過死亡受體通路，目前許多研究證明，凋亡通路也會(huì)通過線粒體途徑。在調(diào)控線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)家族蛋白及它們的相互作用發(fā)揮了重要的作用。
　　 bcl-2基因?qū)€粒體膜的完整性具有保護(hù)作用，可能是此基因抗凋亡作用的主要機(jī)制。bcl-2基因表達(dá)增高，抑制細(xì)胞凋亡。凋亡基因bax則是Bcl-2家族的另一個(gè)重要成員，不但

3、可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而且是凋亡途徑關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Bcl-2家族蛋白中促凋亡與促生存蛋白之間的相互作用控制細(xì)胞色素C等物質(zhì)從線粒體釋放，對(duì)線粒體凋亡路徑發(fā)揮了十分重要的調(diào)控作用。
　　 PC12細(xì)胞作為神經(jīng)元細(xì)胞模型，廣泛用于神經(jīng)生理、病理及藥理方面研究。本實(shí)驗(yàn)選用PC12作為研究對(duì)象，探討B(tài)cl-2家族基因是否參與TNF-α對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用。利用不同濃度TNF-α，分別作用于PC12細(xì)胞，并檢測(cè)同一濃度不同時(shí)間點(diǎn)PC12細(xì)胞的

4、凋亡相關(guān)基因bcl-2 mRNA和bax mRNA表達(dá)情況，希望能夠?yàn)檠芯亢椭委熒窠?jīng)變性疾病以及TNF-α相關(guān)疾病的治療新策略提供有力的理論基礎(chǔ)。
　　 材料與方法
　　 一、PC12細(xì)胞培養(yǎng)
　　 PC12細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，其中含5％胎牛血清、10％馬血清，接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。
　　 二、生化指標(biāo)的測(cè)定
　　 1

5、、MTT法檢測(cè)不同濃度TNF-α作用下PC12細(xì)胞生存率。
　　 2、Annexin V/PI雙染法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度TNF-α作用下PC12細(xì)胞凋亡率。
　　 3、Annexin V/PI雙染法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)30ng/ml TNF-α作用下不同時(shí)間點(diǎn)PC12細(xì)胞凋亡率。
　　 4、30ng/ml TNF-α作用下不同時(shí)間點(diǎn)PC12細(xì)胞電鏡形態(tài)學(xué)觀察。
　　 5、Real time PCR法檢測(cè)不

6、同時(shí)間點(diǎn)PC12細(xì)胞bcl-2 mRNA、bax mRNA表達(dá)。
　　 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行分析，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1、不同濃度TNF-α對(duì)PC12細(xì)胞的影響結(jié)果
　　 細(xì)胞生存率隨著TNF-α濃度增加而降低，并呈濃度-效應(yīng)關(guān)系。其中濃度為30ng/ml時(shí)細(xì)胞生存率為50

7、.65％，細(xì)胞凋亡率為41.64％。
　　 2、30ng/ml TNF-α作用下各時(shí)間點(diǎn)PC12細(xì)胞凋亡結(jié)果
　　 采用30ng/ml TNF-α處理PC12細(xì)胞，0h、6h、12h、24h后，Annexin V/PI雙染法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)PC12細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30ng/mlTNF-α作用于PC12細(xì)胞24h時(shí)細(xì)胞凋亡率最高(P<0.05)。
　　 3、30ng/ml TNF-α作用下0h和2

8、4h時(shí)間點(diǎn)PC12細(xì)胞電鏡觀察結(jié)果
　　 未加藥組PC12細(xì)胞呈圓形，微絨毛豐富，胞漿內(nèi)見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體及糖原顆粒，核巨大且切跡明顯；24h組可見細(xì)胞核碎裂及細(xì)胞質(zhì)空泡化，細(xì)胞膜光滑無突起，染色質(zhì)濃集。
　　 4、30ng/ml TNF-α作用下各時(shí)間點(diǎn)PC12細(xì)胞bcl-2和bax mRNA表達(dá)結(jié)果
　　 采用real time PCR檢測(cè)bcl-2 mRNA和bax mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，與0h組相比較

9、，bax mRNA明顯上調(diào)(P<0.05)；與Oh組相比較，bcl-2 mRNA明顯下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、隨著TNF-α濃度升高PC12細(xì)胞生存率降低，呈濃度-效應(yīng)關(guān)系。
　　 2、在30ng/ml TNF-α濃度作用下，0～24h內(nèi)24h時(shí)間點(diǎn)PC12細(xì)胞凋亡率最高(P<0.05)。
　　 3、TNF-α可降低PC12細(xì)胞中bcl-2 mRNA表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)bax mRNA表達(dá)，