HLA-B27拮抗肽真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步研究.pdf_第1頁(yè)
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1、強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,AS)是一種嚴(yán)重危害人類身體健康和生存質(zhì)量,并嚴(yán)重影響勞動(dòng)力的慢性全身性自身免疫性疾病,其起病隱匿,病程長(zhǎng),最終導(dǎo)致患者喪失活動(dòng)能力,甚至致殘。迄今AS的病因尚不不清楚,其發(fā)病機(jī)制并不明確,目前無(wú)任何特異性治療方法,因此有關(guān)AS治療策略的探索始終是國(guó)內(nèi)外研究尤為關(guān)注的焦點(diǎn)、熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前所使用藥物與方案仍以非特異性緩解對(duì)癥療法為主,這會(huì)產(chǎn)生多種多樣的毒副作用。因此,如何研創(chuàng)出高

2、效、低毒、特異的新型藥物,使其既能迅速緩解AS的癥狀,又能地選擇性有效阻斷AS的病理過(guò)程已成為風(fēng)濕免疫學(xué)領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題!
  從理論上講,任何能夠有效減少、抑制或阻斷AS病理生理發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程的藥物都能有效減輕或緩解AS的骨關(guān)節(jié)病變。鑒于HLA-B27是AS發(fā)生發(fā)展的免疫過(guò)程的中心環(huán)節(jié),選擇性阻斷HLA-B27信號(hào)途徑就成為有效治療AS自身免疫性疾病的重要策略之一。所以本課題擬將免疫阻斷與基因治療性疫苗兩大策略進(jìn)行有機(jī)結(jié)合

3、,創(chuàng)新性研制出基于阻斷HLA-B27信號(hào)途徑的全新治療性基因疫苗。本研究在前期工作中采用HLA-B*2704及HLA-B*2705重鏈胞外區(qū)蛋白篩選噬菌體12肽隨機(jī)肽庫(kù)并獲得了能與其特異性結(jié)合的拮抗肽(antagonistpeptide,AP)。
  本研究的主要目的是對(duì)篩選得到的AS治療性疫苗:HLA-B*2705-AP進(jìn)行真核表達(dá)載體的構(gòu)建、體外表達(dá)鑒定,并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行初步研究。本研究首先對(duì)HLA-B*2705-AP進(jìn)行

4、了pcDNA3.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)鑒定,并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了初步研究。但是,由于HLA-B27拮抗肽分子量特別小,不利于體外實(shí)驗(yàn)鑒定與觀察,所以本研究又進(jìn)一步構(gòu)建了融合有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白編碼基因的pcDNA3.1/HLA-B*2704-AP-EGFP的融合表達(dá)載體和pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP的融合表達(dá)載體。通過(guò)系列研究獲得如下研究結(jié)果:
  第一部分:pcDNA3.1/B*2705-AP真核

5、表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步研究
  1.通過(guò)PCR的方法得到了HLA-B*2705-AP基因,確定了所用的PCR條件為:98℃預(yù)變性5分鐘后;98℃變性10秒,60℃退火15秒,72℃延伸30秒,共30個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸8分鐘,最后于4℃保存。PCR得到目的基因?yàn)?22bp。
  2.得到的HLA-B*2705-AP基因通過(guò)T4連接酶連接到pMD18-T載體后在大腸桿菌Top10進(jìn)行克隆,并且菌落P

6、CR和測(cè)序結(jié)果表明目的基因已經(jīng)連接到載體中。
  3.得到的pMD18-T/HLA-B*2705-AP載體和pcDNA3.1(+)載體經(jīng)過(guò)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切,構(gòu)建pcDNA3.1(+)/HLA-B*2705-AP重組載體載體后在大腸桿菌Top10進(jìn)行克隆,并且菌落PCR和測(cè)序結(jié)果表明目的基因已經(jīng)連接到載體中。
  4.將重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/HLA-B*2705-AP轉(zhuǎn)染cos7細(xì)胞,重組表達(dá)載體通過(guò)Ge

7、nFectin介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)到真核細(xì)胞中,進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞中B*2705拮抗肽-蛋白的表達(dá),電泳結(jié)果表明轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的細(xì)胞在100bp處可見(jiàn)特異性條帶,而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒(méi)有該條帶。
  5.通過(guò)補(bǔ)體依賴性HLA-B27陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),所轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞的上清可以有效阻斷特異性HLA-B27的殺傷作用。
  第二部分:pcDNA3.1/B*2705/2704-AP-EGFP融合基因

8、真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及其生物學(xué)活性的
  1.初步研究通過(guò)PCR的方法得到了HLA-B*2705-AP及HLA-B*2704-AP基因,確定了所用的PCR條件為:98℃預(yù)變性5分鐘后;98℃變性10秒,60℃退火15秒,72℃延伸30秒,共30個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸8分鐘,最后于4℃保存。PCR得到目的基因?yàn)?22bp.。
  2.得到的HLA-B*2705-AP及HLA-B*2704-AP基因片段和pcDNA3

9、.1(+)-EGFP載體經(jīng)過(guò)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切,分別構(gòu)建pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP以及pcDNA3.1/HLA-B*2704-AP-EGFP的融合表達(dá)載體,并在大腸桿菌Top10進(jìn)行克隆,經(jīng)菌落PCR和測(cè)序結(jié)果表明目的基因已經(jīng)連接到載體中。
  3.將重組表達(dá)載體pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP和pcDNA3.1/HLA-B*2704-AP-EGFP的融合表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染CH

10、O細(xì)胞,重組表達(dá)載體通過(guò)GenFectin介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)到真核細(xì)胞中并進(jìn)行表達(dá)。在熒光顯微鏡下可以清晰地看到在細(xì)胞中所表達(dá)的綠色熒光蛋白,經(jīng)流式結(jié)果表明熒光細(xì)胞占總細(xì)胞的比例分別是64.86%和57.91%,表明轉(zhuǎn)染效率較高。
  4.通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞中B*2705-AP-EGFP及B*2704-AP-EGFP蛋白的表達(dá),轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的細(xì)胞在1000bp處可見(jiàn)特異性條帶(測(cè)序引物CMV-f和BGH-r),而

11、轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞未出現(xiàn)此條帶,這說(shuō)明該細(xì)胞已整合了該融合蛋白的mRNA。
  5.采用WesternBlot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的抗原性。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染重組載體的細(xì)胞在相對(duì)分子質(zhì)量約30KD處有陽(yáng)性條帶,而空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)任何條帶顯示。
  6.在抗HLA-B27抗血清介導(dǎo)的補(bǔ)體依賴性HLA-B27陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒的實(shí)驗(yàn)中,100%的細(xì)胞死亡。若向此實(shí)驗(yàn)體系中加入5μl轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒B*2705-AP-EGFP及B

12、*2704-AP-EGFP的細(xì)胞破碎的上清,分別有50%和40%的細(xì)胞毒反應(yīng)被阻斷,說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白有特異性阻斷B27反應(yīng)的能力。
  7.熒光顯微鏡分別檢測(cè)拮抗肽與細(xì)胞的結(jié)合情況,B*2705-AP-EGFP和B*2704-AP-EGFP與正常HLA-B27陰性B細(xì)胞不結(jié)合,而可分別與HLA-B*2705及B*2704陽(yáng)性細(xì)胞株結(jié)合,表明這種結(jié)合具有特異性,同時(shí)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的方法更進(jìn)一步的證明了結(jié)合的特異性。
  綜

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