融合蛋白TAT-XIAP的原核表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步鑒定.pdf

1、目的:體外合成X連鎖調(diào)亡抑制蛋白(XIAP)基因編碼區(qū)序列,將其插入空載體pTAT-HA質(zhì)粒,構(gòu)建pTAT-XIAP原核表達(dá)載體,獲得高產(chǎn)量、高純度的TAT-XIAP目的蛋白,蛋白復(fù)性后并研究融合蛋白TAT-XIAP的生物學(xué)活性。
　　方法:體外合成大鼠 XIAP基因編碼區(qū)序列,將其插入 pTAT-HA質(zhì)粒,構(gòu)建重組表達(dá)載體pTAT-XIAP,Nco I和 Xho I酶對(duì) pTAT-XIAP質(zhì)粒 DNA進(jìn)行雙酶切并測(cè)序無誤后,將

2、pTAT-XIAP重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌(E.coli)表達(dá)菌株 BL21plysS。隨機(jī)挑取陽性克隆的單菌落,接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜,當(dāng)OD600=0.8-1時(shí),加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1mM,誘導(dǎo)4h,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示目的蛋白主要以包涵體的形式存在。進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件,SDS-PAGE及蛋白印跡法(western blot)鑒定目的蛋白TAT-

3、XIAP的表達(dá)形式。取TAT-XIAP包涵體蛋白溶解于8M尿素4℃過夜,離心取上清加入鎳離子親和層析柱(Ni2+-NTA),在變性的條件下,用20mM和50mM咪唑溶液各15mL進(jìn)行洗脫,100mM咪唑溶液收集純化的TAT-XIAP目的蛋白。SDS-PAGE鑒定該蛋白的純化效果。將純化后的TAT-XIAP蛋白、10％甘油和0.014mol/L的β-巰基乙醇裝入透析袋,依次用6M、5M、4M、2M、1M尿素緩沖液和PBS4℃磁力攪拌進(jìn)行透

4、析,獲得了復(fù)性的TAT-XIAP融合蛋白。取CEN2對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,不同濃度的融合蛋白TAT-XIAP作用不同時(shí)間,MTT法檢測(cè)TAT-XIAP融合蛋白對(duì)CEN2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。SD大鼠腹腔注射復(fù)性后的TAT-XIAP融合蛋白,于注射12h后斷頭取大腦組織,冰凍切片,厚約6μm,免疫熒光顯微鏡下觀察TAT-XIAP融合蛋白在腦組織的分布情況。
　　結(jié)果:1.1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示pTAT-XIAP質(zhì)粒DNA約4.5kb,pT

5、AT-HA質(zhì)粒DNA約3kb。pTAT-XIAP質(zhì)粒DNA經(jīng)NcoI/XhoI酶切鑒定,電泳結(jié)果顯示在Marker約3kb處可見空載體 pTAT-HA的條帶,在 Marker約1.5kb處可見 XIAP的條帶。2.12%SDS-PAGE結(jié)果顯示TAT-XIAP目的蛋白分子量約64kD,該蛋白主要以包涵體的形式存在,經(jīng)調(diào)整誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間等進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)條件,發(fā)現(xiàn) TAT-XIAP目的蛋白仍主要以包涵體的形式存在。TAT-

6、XIAP目的蛋白在變性條件下經(jīng)鎳離子親和層析柱純化,獲得了高產(chǎn)量、高純度的 TAT-XIAP目的蛋白。TAT-XIAP融合蛋白經(jīng) SDS-PAGE和western blot分析,在分子量約64kD處有一明顯表達(dá)條帶,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論結(jié)果相符。3.蛋白復(fù)性后,MTT法檢測(cè)TAT-XIAP融合蛋白對(duì)CEN2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后,結(jié)果顯示TAT-XIAP融合蛋白對(duì)CEN2細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。4.免疫熒光結(jié)果顯示SD大鼠腦組織中有

7、大量綠色熒光信號(hào),其中以大腦皮質(zhì)、基底節(jié)處多見。該蛋白主要分布在細(xì)胞漿中。PBS對(duì)照組除非特異性著色外,未見明顯陽性綠色熒光信號(hào)。
　　結(jié)論:1.成功構(gòu)建 pTAT-XIAP原核表達(dá)載體并表達(dá)出目的蛋白。2.重組蛋白 TAT-XIAP經(jīng)鎳離子親和層析純化,獲得了高產(chǎn)量、高純度的目的蛋白。3.重組蛋白TAT-XIAP復(fù)性成功,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該蛋白可成功穿透血腦屏障,MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TAT-XIAP融合蛋白對(duì)CEN2細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,