人tmTNF-α單鏈抗體的構(gòu)建、表達(dá)及其生物學(xué)活性鑒定.pdf

1、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factorα，TNF-α）主要是由單核巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生，它有分泌型TNF-α(secretory TNF-α，sTNF-α)和跨膜型TNF-α(transmembrane TNF-α，tmTNF-α)兩種形式。盡管TNF-α對(duì)多種腫瘤具有殺傷作用，但大量研究證實(shí)sTNF-α可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、新生血管形成和轉(zhuǎn)移。前期工作證實(shí)乳腺癌、卵巢癌、肝癌、急性淋巴細(xì)胞白血病和淋巴瘤等均有部分病例高表達(dá)tmT

2、NF-α，但是癌旁組織則不表達(dá)；tmTNF-α明顯促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及抵抗凋亡。提示tmTNF-α可作為腫瘤標(biāo)記物，是比較理想的腫瘤靶向治療的分子靶點(diǎn)。
　　目前上市的抗TNF-α抗體，如Infliximab、Adalimumab、Certolizumab pegol和Golimumab均可與兩型TNF-α結(jié)合，由于sTNF-α可消耗抗體，故限制這些抗體應(yīng)用于腫瘤治療。本室前期工作篩選到針對(duì)tmTNF-α的特異性單克隆抗體，由于該

3、抗體不與sTNF-α發(fā)生交叉反應(yīng)，故比現(xiàn)有抗體更具有優(yōu)勢(shì)用于腫瘤治療。本研究擬在tmTNF-α單克隆抗體的基礎(chǔ)上，制備單鏈抗體，并與HSA連接，為研制特異性免疫毒素奠定基礎(chǔ)。
　　主要結(jié)果如下：
　　一、pET28a-tmTNF-α-scFv質(zhì)粒的構(gòu)建與原核表達(dá)
　　1.構(gòu)建pET28a-tmTNF-α-scFv：以人鼠嵌合抗體pIRES/C1為模板分別PCR獲得抗tmTNF-α單克隆抗體可變區(qū)基因序列VH（411bp

4、），VL（396bp），再以VH，VL為模板重疊延伸PCR獲得目的片段tmTNF-α-scFv（VH-linker-VL），插入T載體，經(jīng)測(cè)序證實(shí)無(wú)誤，用EcoRI，XhoI雙酶切，插入pET28a原核表達(dá)載體，獲得pET28a-tmTNF-α-scFv重組質(zhì)粒。
　　2.原核表達(dá)tmTNF-α-scFv：將pET28a-tmTNF-α-scFv重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL-21中表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)5h后，可見(jiàn)目的蛋白表達(dá)量較高，分子量為3

5、0kD，且主要分布在包涵體。經(jīng)鎳柱純化，其純度可達(dá)91.4％。
　　二、tmTNF-α單鏈抗體生物學(xué)活性鑒定
　　1. ELISA檢測(cè)證實(shí)tmTNF-α-scFv與其親本單克隆抗體一樣，可有效與tmTNF-α的NTF段結(jié)合。
　　2. FCM檢測(cè)證實(shí)tmTNF-α-scFv與其親本單克隆抗體一樣，可有效與表達(dá)tmTNF-α的Raji細(xì)胞結(jié)合，幾乎不與低表達(dá)tmTNF-α的MCF-7細(xì)胞結(jié)合。
　　上述結(jié)果提示tm

6、TNF-α-scFv保留親本抗體結(jié)合抗原的特異性。
　　三、tmTNF-α-scFv單鏈抗體與HSA的連接
　　以HSA，VH-linker-VL作為模板，重疊延伸PCR獲得HSA-VH-linker-VL（即HSA-tmTNF-α-scFv）目的片段，插入T載體中，經(jīng)測(cè)序證實(shí)無(wú)誤，用EcoRI，NotI雙酶切，插入酵母表達(dá)載體pPIC9K中，為后續(xù)酵母表達(dá)，并連接毒素奠定基礎(chǔ)。
　　結(jié)論：成功地構(gòu)建和原核表達(dá)了人tm