細(xì)胞因子與表達(dá)Fas配體人結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移及浸潤關(guān)系的研究.pdf

1、大腸癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，大腸癌肝轉(zhuǎn)移是影響其長期生存的重要因素。進(jìn)行大腸癌根治性切除術(shù)后的病人近一半由于疾病復(fù)發(fā)在5年內(nèi)死亡，絕大多數(shù)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。大腸癌以肝轉(zhuǎn)移最為常見，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移率為50％左右。大腸癌肝轉(zhuǎn)移的患者僅5％～10％可得到肝切除的機(jī)會(huì)，肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后患者5年存活率達(dá)20％～40％(1)。絕大多數(shù)的肝轉(zhuǎn)移由于腫瘤的數(shù)目、大小、位置及病人的全身狀況不允許被切除。肝轉(zhuǎn)移是大腸癌晚期患者死亡的主要原因。大腸癌肝轉(zhuǎn)移包括多個(gè)

2、步驟，癌細(xì)胞從原發(fā)部位侵入血管，與肝血管內(nèi)皮細(xì)胞附著，穿透進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)并定居。眾所周知，腫瘤細(xì)胞的侵襲及其逃避機(jī)體免疫監(jiān)控是腫瘤轉(zhuǎn)移的要素。腫瘤轉(zhuǎn)移的結(jié)果依賴于惡性細(xì)胞與宿主環(huán)境復(fù)雜的相互作用。通過改變腫瘤細(xì)胞增殖與死亡的平衡，惡性細(xì)胞與宿主環(huán)境的相互作用可影響原發(fā)癌的生長及轉(zhuǎn)移。 凋亡或程序化細(xì)胞死亡在正常細(xì)胞調(diào)控中起重要作用，同時(shí)被細(xì)胞內(nèi)外的各種信號(hào)所調(diào)控。Fas抗原(APO-1/CD95)與Fas配體(FasL)組成的Fas

3、系統(tǒng)，在將凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要作用。效應(yīng)細(xì)胞FasL結(jié)合靶細(xì)胞Fas抗原后，在數(shù)小時(shí)內(nèi)通過細(xì)胞凋亡途徑使靶細(xì)胞死亡。近年來很多研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as在多種細(xì)胞表面均有表達(dá)，而FasL表達(dá)只限于少量細(xì)胞類型，諸如淋巴細(xì)胞、免疫特權(quán)器官的細(xì)胞和多種惡性腫瘤細(xì)胞，同時(shí)已證實(shí)表達(dá)FasL的腫瘤周圍激活的Fas陽性淋巴細(xì)胞凋亡異常增加。另一方面，腫瘤的發(fā)生在很大程度上是因?yàn)檗D(zhuǎn)化的細(xì)胞不能正常凋亡所致。根據(jù)早期的文獻(xiàn)，通過表達(dá)Fas配體及對(duì)Fas

4、介導(dǎo)凋亡途徑的抵抗可能會(huì)使多種腫瘤對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)先攻擊或反擊。 大腸癌病人肝轉(zhuǎn)移的高發(fā)病率表明肝提供了有助于轉(zhuǎn)移發(fā)生的環(huán)境。轉(zhuǎn)移的瘤細(xì)胞必須逃逸免疫監(jiān)視，在繼發(fā)部位侵襲和替代局部組織才能形成轉(zhuǎn)移瘤。腫瘤侵襲的一些機(jī)制包括：降解細(xì)胞外基質(zhì)的金屬蛋白酶的釋放，促進(jìn)新生血管形成的生長因子的分泌，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移的粘附分子的改變。然而，雖然替代正常組織是腫瘤生長的前提，但大腸癌替代和破壞肝細(xì)胞的確切機(jī)制卻不為人所知。肝細(xì)胞對(duì)Fas

5、介導(dǎo)的凋亡特別敏感，因?yàn)樽⑸淇笷as抗體可誘導(dǎo)肝臟的嚴(yán)重?fù)p傷，而在別處并未發(fā)生。最近發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)FasL對(duì)腫瘤細(xì)胞在肝定居上起著關(guān)鍵作用。Yoong等(2)證實(shí)腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤邊緣的肝細(xì)胞Fas表達(dá)被顯著上調(diào)，許多肝細(xì)胞遭受凋亡。闡明腫瘤和其微環(huán)境的相互作用提高了醫(yī)生對(duì)轉(zhuǎn)移形成的生物學(xué)機(jī)制的理解。制定有效的生物療法將依賴于正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞復(fù)雜交互作用的理解，以及細(xì)胞因子與在特定位置特定腫瘤內(nèi)所有細(xì)胞的相互作用。 本研究的目的

6、是研究體外細(xì)胞因子對(duì)表達(dá)Fas配體人結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移及浸潤的影響。 第一部分細(xì)胞因子促進(jìn)表達(dá)Fas配體人結(jié)腸癌細(xì)胞免疫逃逸目的：探討結(jié)腸癌細(xì)胞自身表達(dá)FasL的作用和內(nèi)源性細(xì)胞因子對(duì)腫瘤細(xì)胞反擊T淋巴細(xì)胞的影響。方法：用免疫組織化學(xué)SP法及RT-PCR法觀察結(jié)腸癌細(xì)胞系和JurkatT淋巴細(xì)胞系Fas與FasL的表達(dá)，為結(jié)腸癌細(xì)胞和JurkatT淋巴細(xì)胞Fas和FasL的功能提供mRNA水平及形態(tài)學(xué)依據(jù)。采用非放射性細(xì)胞毒分析，

7、測(cè)定SW620結(jié)腸癌細(xì)胞與Jurkat靶細(xì)胞共培養(yǎng)后LDH釋放值檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果：PMA加離子霉素刺激后或TNF-α刺激后或IL-18刺激后大腸癌SW620細(xì)胞FasLmRNA水平明顯上調(diào)。結(jié)腸癌SW620細(xì)胞FasL染色呈陽性反應(yīng)，陽性反應(yīng)物主要定位于癌細(xì)胞的胞膜及核周區(qū)，而Fas染色幾乎呈陰性反應(yīng)。Jurkat細(xì)胞系Fas、FasL免疫組化染色呈陽性反應(yīng)，陽性反應(yīng)物主要定位于癌細(xì)胞的胞膜。CytoTox96~非放射性細(xì)胞

8、毒分析顯示PHA激活的靶T細(xì)胞(JurkatT細(xì)胞)分別與PMA加離子霉素刺激(48h)后或TNF-α刺激(48h)后或IL-18刺激(36h)后或未刺激的大腸癌SW620效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)，在E:T為10:1，5:1，2.5:1，1.25:1細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)分別為74.6％，40.8％，32.4％，10.9％(F=8.19，P＜0.05)；54.9％，35.3％，22.0％，10.3％(F=11.12，P＜0.05)；52.5％，33

9、.1％，19.8％，10.1％(F=9.19，P＜0.05)和14.9％，10.5％，6.9％，5.8％(F=3.45，P＜0.05)。未刺激的SW620細(xì)胞與PHA激活的Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)8小時(shí)，在E:T為5:1，2.5:1，1.25:1細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)分別為83.9％，74.1％和28.5％(F=137.04，P＜0.05)。非放射性細(xì)胞毒分析顯示大腸癌SW620細(xì)胞系與激活的T細(xì)胞(JurkatT細(xì)胞)共培養(yǎng)后，隨著SW620接

10、種濃度增加和共培養(yǎng)時(shí)間的延長，JurkatT細(xì)胞凋亡的比例顯著增加。PMA加離子霉素或TNF-α或IL-18能顯著增強(qiáng)大腸癌的細(xì)胞毒活性。結(jié)論：宿主微環(huán)境中的內(nèi)源性細(xì)胞因子調(diào)控人結(jié)腸癌細(xì)胞FasL表達(dá)，有助于腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視系統(tǒng)。 第二部分大腸癌肝轉(zhuǎn)移中Fas/FasL的相互作用與細(xì)胞因子關(guān)系的研究目的：探討內(nèi)源性細(xì)胞因子和結(jié)腸癌細(xì)胞自身表達(dá)FasL的相互作用對(duì)大腸癌肝轉(zhuǎn)移及浸潤的影響。方法：采用免疫組織化學(xué)、RT-PC

11、R法檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系和Chang肝細(xì)胞系Fas與FasL的表達(dá)，為結(jié)腸癌細(xì)胞和Chang肝細(xì)胞Fas和FasL的功能提供mRNA水平及形態(tài)學(xué)上的依據(jù)。采用非放射性細(xì)胞毒分析，測(cè)定SW620結(jié)腸癌細(xì)胞與Chang肝細(xì)胞共培養(yǎng)后LDH釋放值檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果：TNF-α刺激后或IL-18刺激后大腸癌SW620細(xì)胞FasLmRNA水平明顯上調(diào)。結(jié)腸癌SW620細(xì)胞FasL染色呈陽性反應(yīng)，陽性反應(yīng)物主要定位于癌細(xì)胞的胞膜及核周區(qū)，而F

12、as染色幾乎呈陰性反應(yīng)。Chang肝細(xì)胞Fas免疫組化染色呈陽性反應(yīng)，陽性反應(yīng)物主要定位于細(xì)胞的胞膜，而FasL染色呈陰性反應(yīng)。CytoTox96(R)非放射性細(xì)胞毒分析顯示IFN-γ刺激后的靶Chang肝細(xì)胞分別與TNF-α刺激(48h)后或IL-18刺激(36h)后或未刺激的大腸癌SW620效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)6小時(shí)，在E:T為10:1，5:1，2.5:1，1.25:1細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)分別為73.5％，53.2％，24.1％，10.9％(F