細胞因子與表達Fas配體人結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移及浸潤關(guān)系的研究.pdf

1、大腸癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，大腸癌肝轉(zhuǎn)移是影響其長期生存的重要因素。進行大腸癌根治性切除術(shù)后的病人近一半由于疾病復發(fā)在5年內(nèi)死亡，絕大多數(shù)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。大腸癌以肝轉(zhuǎn)移最為常見，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移率為50％左右。大腸癌肝轉(zhuǎn)移的患者僅5％～10％可得到肝切除的機會，肝轉(zhuǎn)移切除術(shù)后患者5年存活率達20％～40％(1)。絕大多數(shù)的肝轉(zhuǎn)移由于腫瘤的數(shù)目、大小、位置及病人的全身狀況不允許被切除。肝轉(zhuǎn)移是大腸癌晚期患者死亡的主要原因。大腸癌肝轉(zhuǎn)移包括多個

2、步驟，癌細胞從原發(fā)部位侵入血管，與肝血管內(nèi)皮細胞附著，穿透進入肝實質(zhì)并定居。眾所周知，腫瘤細胞的侵襲及其逃避機體免疫監(jiān)控是腫瘤轉(zhuǎn)移的要素。腫瘤轉(zhuǎn)移的結(jié)果依賴于惡性細胞與宿主環(huán)境復雜的相互作用。通過改變腫瘤細胞增殖與死亡的平衡，惡性細胞與宿主環(huán)境的相互作用可影響原發(fā)癌的生長及轉(zhuǎn)移。 凋亡或程序化細胞死亡在正常細胞調(diào)控中起重要作用，同時被細胞內(nèi)外的各種信號所調(diào)控。Fas抗原(APO-1/CD95)與Fas配體(FasL)組成的Fas

3、系統(tǒng)，在將凋亡信號轉(zhuǎn)導入細胞內(nèi)發(fā)揮重要作用。效應細胞FasL結(jié)合靶細胞Fas抗原后，在數(shù)小時內(nèi)通過細胞凋亡途徑使靶細胞死亡。近年來很多研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as在多種細胞表面均有表達，而FasL表達只限于少量細胞類型，諸如淋巴細胞、免疫特權(quán)器官的細胞和多種惡性腫瘤細胞，同時已證實表達FasL的腫瘤周圍激活的Fas陽性淋巴細胞凋亡異常增加。另一方面，腫瘤的發(fā)生在很大程度上是因為轉(zhuǎn)化的細胞不能正常凋亡所致。根據(jù)早期的文獻，通過表達Fas配體及對Fas

4、介導凋亡途徑的抵抗可能會使多種腫瘤對機體免疫系統(tǒng)進行優(yōu)先攻擊或反擊。 大腸癌病人肝轉(zhuǎn)移的高發(fā)病率表明肝提供了有助于轉(zhuǎn)移發(fā)生的環(huán)境。轉(zhuǎn)移的瘤細胞必須逃逸免疫監(jiān)視，在繼發(fā)部位侵襲和替代局部組織才能形成轉(zhuǎn)移瘤。腫瘤侵襲的一些機制包括：降解細胞外基質(zhì)的金屬蛋白酶的釋放，促進新生血管形成的生長因子的分泌，促進腫瘤細胞遷移的粘附分子的改變。然而，雖然替代正常組織是腫瘤生長的前提，但大腸癌替代和破壞肝細胞的確切機制卻不為人所知。肝細胞對Fas

5、介導的凋亡特別敏感，因為注射抗Fas抗體可誘導肝臟的嚴重損傷，而在別處并未發(fā)生。最近發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞表達FasL對腫瘤細胞在肝定居上起著關(guān)鍵作用。Yoong等(2)證實腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤邊緣的肝細胞Fas表達被顯著上調(diào)，許多肝細胞遭受凋亡。闡明腫瘤和其微環(huán)境的相互作用提高了醫(yī)生對轉(zhuǎn)移形成的生物學機制的理解。制定有效的生物療法將依賴于正常細胞與腫瘤細胞復雜交互作用的理解，以及細胞因子與在特定位置特定腫瘤內(nèi)所有細胞的相互作用。 本研究的目的

6、是研究體外細胞因子對表達Fas配體人結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移及浸潤的影響。 第一部分細胞因子促進表達Fas配體人結(jié)腸癌細胞免疫逃逸目的：探討結(jié)腸癌細胞自身表達FasL的作用和內(nèi)源性細胞因子對腫瘤細胞反擊T淋巴細胞的影響。方法：用免疫組織化學SP法及RT-PCR法觀察結(jié)腸癌細胞系和JurkatT淋巴細胞系Fas與FasL的表達，為結(jié)腸癌細胞和JurkatT淋巴細胞Fas和FasL的功能提供mRNA水平及形態(tài)學依據(jù)。采用非放射性細胞毒分析，

7、測定SW620結(jié)腸癌細胞與Jurkat靶細胞共培養(yǎng)后LDH釋放值檢測效應細胞的殺傷效應。結(jié)果：PMA加離子霉素刺激后或TNF-α刺激后或IL-18刺激后大腸癌SW620細胞FasLmRNA水平明顯上調(diào)。結(jié)腸癌SW620細胞FasL染色呈陽性反應，陽性反應物主要定位于癌細胞的胞膜及核周區(qū)，而Fas染色幾乎呈陰性反應。Jurkat細胞系Fas、FasL免疫組化染色呈陽性反應，陽性反應物主要定位于癌細胞的胞膜。CytoTox96~非放射性細胞

8、毒分析顯示PHA激活的靶T細胞(JurkatT細胞)分別與PMA加離子霉素刺激(48h)后或TNF-α刺激(48h)后或IL-18刺激(36h)后或未刺激的大腸癌SW620效應細胞共培養(yǎng)4小時，在E:T為10:1，5:1，2.5:1，1.25:1細胞毒殺傷效應分別為74.6％，40.8％，32.4％，10.9％(F=8.19，P＜0.05)；54.9％，35.3％，22.0％，10.3％(F=11.12，P＜0.05)；52.5％，33

9、.1％，19.8％，10.1％(F=9.19，P＜0.05)和14.9％，10.5％，6.9％，5.8％(F=3.45，P＜0.05)。未刺激的SW620細胞與PHA激活的Jurkat細胞共培養(yǎng)8小時，在E:T為5:1，2.5:1，1.25:1細胞毒殺傷效應分別為83.9％，74.1％和28.5％(F=137.04，P＜0.05)。非放射性細胞毒分析顯示大腸癌SW620細胞系與激活的T細胞(JurkatT細胞)共培養(yǎng)后，隨著SW620接

10、種濃度增加和共培養(yǎng)時間的延長，JurkatT細胞凋亡的比例顯著增加。PMA加離子霉素或TNF-α或IL-18能顯著增強大腸癌的細胞毒活性。結(jié)論：宿主微環(huán)境中的內(nèi)源性細胞因子調(diào)控人結(jié)腸癌細胞FasL表達，有助于腫瘤細胞逃逸機體免疫監(jiān)視系統(tǒng)。 第二部分大腸癌肝轉(zhuǎn)移中Fas/FasL的相互作用與細胞因子關(guān)系的研究目的：探討內(nèi)源性細胞因子和結(jié)腸癌細胞自身表達FasL的相互作用對大腸癌肝轉(zhuǎn)移及浸潤的影響。方法：采用免疫組織化學、RT-PC

11、R法檢測結(jié)腸癌細胞系和Chang肝細胞系Fas與FasL的表達，為結(jié)腸癌細胞和Chang肝細胞Fas和FasL的功能提供mRNA水平及形態(tài)學上的依據(jù)。采用非放射性細胞毒分析，測定SW620結(jié)腸癌細胞與Chang肝細胞共培養(yǎng)后LDH釋放值檢測效應細胞的殺傷效應。結(jié)果：TNF-α刺激后或IL-18刺激后大腸癌SW620細胞FasLmRNA水平明顯上調(diào)。結(jié)腸癌SW620細胞FasL染色呈陽性反應，陽性反應物主要定位于癌細胞的胞膜及核周區(qū)，而F

12、as染色幾乎呈陰性反應。Chang肝細胞Fas免疫組化染色呈陽性反應，陽性反應物主要定位于細胞的胞膜，而FasL染色呈陰性反應。CytoTox96(R)非放射性細胞毒分析顯示IFN-γ刺激后的靶Chang肝細胞分別與TNF-α刺激(48h)后或IL-18刺激(36h)后或未刺激的大腸癌SW620效應細胞共培養(yǎng)6小時，在E:T為10:1，5:1，2.5:1，1.25:1細胞毒殺傷效應分別為73.5％，53.2％，24.1％，10.9％(F