胡椒堿對人結腸癌細胞系表達炎癥因子和抗菌肽的影響.pdf

1、目的：
　　胡椒堿(Piperine，Pip)是胡椒(Piper nigrum Linn)和蓽茇(Piper longum Linn)等胡椒屬植物果實中提取的一種植物堿，是胡椒中發(fā)揮藥理作用的主要成分。近年的研究表明胡椒堿具有明確的抗炎效應并且對多種胃腸疾病具有療效，但關于胡椒堿在腸炎方面的研究很少，其抗腸炎作用的機制也還不夠清楚。本課題通過利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或滅活的金黃色葡萄球菌(Stap

2、hylococcus aureus cells，SAC)分別刺激人結腸癌細胞系(SW480、HT-29和Caco-2細胞)，體外模擬人腸道感染細菌發(fā)生炎癥，檢測Pip對LPS或SAC作用下這些細胞表達炎癥因子、抗菌肽防御素以及對NF-κB信號通路、MAPKs信號通路活化的影響，初步探討Pip發(fā)揮抗腸炎作用的機制。
　　方法：
　　1.采用改進的MTT法(WST-1)檢測Pip對SW480、HT-29、Caco-2細胞增殖的作

3、用；利用流式微球捕獲蛋白定量技術(Cytometric beads array，CBA)檢測Pip對LPS刺激SW480和HT-29細胞分泌炎癥因子IL-8和IL-10的蛋白表達水平的影響，并用RT-qPCR(Reverse Transcription-Quantitative PCR)檢測炎癥因子 mRNA表達水平的變化；免疫印跡法(Western blotting)檢測 Pip對LPS活化的SW480細胞 NF-κB信號通路、ERK

4、、p38 MAPK和JNK信號通路的調節(jié)作用；利用 CBA和RT-qPCR分別在蛋白質水平以及 mRNA水平上分析 p38 MAPK和JNK信號通路阻斷情況，即在SB203580(p38 MAPK信號通路抑制劑)和SP600125(JNK信號通路抑制劑)作用下，對LPS刺激SW480和HT-29細胞表達IL-8的影響。
　　2.利用RT-qPCR檢測Pip對LPS和SAC抑制HT-29、Caco-2細胞表達抗菌肽人α防御素HD5(

5、human alpha-defensin-5)和HD6(human alpha-defensin-6)，人β防御素 HBD-1(human beta-defensin-1)以及胰島再生源蛋白(regenerating islet-derived protein，Reg) RegⅢγmRNA的調節(jié)作用。
　　結果：
　　1. Pip處理可劑量依賴性地抑制SW480、HT-29和Caco-2細胞的增殖，半數(shù)抑制濃度IC50分別為

6、147.6μM、328.5μM和155.1μM，表明Pip對這些細胞的毒性較小。CBA和RT-qPCR檢測結果顯示Pip能從蛋白質水平及 mRNA水平上抑制由LPS誘導的SW480和HT-29細胞表達IL-8，且蛋白質水平上的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關系；而免疫印跡分析表明，Pip可抑制LPS誘導的p38 MAPK和JNK信號通路的活化；CBA和RT-qPCR檢測結果顯示使用 SB203580抑制p38 MAPK信號通路后，由 LPS誘導的

7、細胞表達 IL-8無論在蛋白質水平及mRNA水平上均有顯著下調。
　　2. RT-qPCR檢測顯示，HT-29和Caco-2細胞HD5、HD6的mRNA表達水平在LPS或SAC的刺激下均有顯著下降，而Pip對LPS或SAC下調HT-29和Caco-2細胞表達抗菌肽防御素具有顯著的拮抗作用。
　　結論：
　　1. Pip能抑制LPS刺激的SW480和HT-29細胞分泌炎癥因子IL-8從而發(fā)揮抗炎作用，其機制很可能與抑制p