尼克酰胺預處理通過改善線粒體應激減少缺氧后心肌細胞死亡.pdf

1、嚴重燒傷早期心肌缺血已經(jīng)聚焦大量的基礎研究和臨床治療。燒傷后心肌缺血常見原因是氧供和營養(yǎng)物質的緩慢耗竭。越來越多的研究表明燒傷后缺血缺氧誘導的細胞壞死和凋亡是燒傷早期心肌功能喪失的主要原因。同時，線粒體失能在心肌缺血死亡的病理生理發(fā)生中也發(fā)揮著關鍵的作用。缺血缺氧導致活性氧簇產(chǎn)生，破壞線粒體復合體完整性，胞內ATP減少與線粒體膜電位降低；彼此相互作用引起線粒體通透性增強，激活前凋亡蛋白和細胞色素c釋放。除此之外，由于細胞能量供應不足，嚴

2、重且長時間的缺血易導致細胞壞死。這些研究均提示維持線粒體功能的重要性，特別在局限燒傷后心肌凋亡和壞死方面。因此，尋找有前景的藥物是治療燒傷后心肌損害的關鍵。
　　 尼克酰胺即煙酰胺，是一種水溶性維生素(維生素B3)，也是輔酶β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的前體。在藥理學上，尼克酰胺在保持正常細胞功能和代謝方面被認為發(fā)揮著重要作用。實驗發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠短暫局部腦缺血后，給予尼克酰胺治療能改善神經(jīng)病變和減小梗死體積。同時，尼克酰胺也能

3、減少腦創(chuàng)傷后急性腦皮質神經(jīng)元死亡和水腫，提示尼克酰胺抗缺血缺氧作用。近來的實驗研究也發(fā)現(xiàn)給小鼠喂養(yǎng)富含尼克酰胺的飲食能促使心肌細胞過表達磺酰脲類受體，從而發(fā)揮抗缺血再灌注損傷作用。但是，目前仍然沒有基礎研究檢測尼克酰胺治療缺氧后心肌細胞壞死和凋亡的直接效應以及其分子機制。
　　 在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下尼克酰胺通過抑制氧化應激和改善能量生成，減少心肌細胞壞死和凋亡從而發(fā)揮心肌保護作用。
　　 一、材料與方法

4、>　　 采用體外實驗的方法。
　　 檢測常氧條件下尼克酰胺抗心肌細胞死亡效應
　　 遵循既有方法，原代乳大鼠心肌細胞從新生SD大鼠(2-3天)的心室分離和培養(yǎng)。給予心肌細胞不同劑量尼克酰胺(2.5，5，10，和20 mM)作用16h后，檢測常氧條件下細胞死亡劑量依賴效應。細胞死亡以Western blot實驗檢測RIP和CC3蛋白表達量進行評估。10mM尼克酰胺預處理后檢測LDH釋放量、ATP，NAD+和NADP+含量

5、，以評估其對心肌細胞的保護效應。
　　 檢測尼克酰胺抗缺氧誘導心肌細胞死亡效應
　　 給予心肌細胞不同劑量尼克酰胺(2.5，5，10，和20 mM)作用16h后，進行6h缺氧(94%N2，5% CO2，1% O2)處理，檢測缺氧條件下其對細胞死亡的劑量依賴效應。以Westernblot實驗檢測RIP和CC3蛋白表達量評估細胞死亡。10mM尼克酰胺預處理后，再缺氧處理6h，以LDH釋放量和TUNEL實驗檢測細胞死亡。

6、>　　 檢測尼克酰胺抗缺氧誘導心肌細胞死亡的保護機制
　　 所有實驗采用10mM尼克酰胺預處理后，再缺氧處理6h，與正常對照組和缺氧組對比。采用激光共聚焦檢測ROS含量、Western blot檢測抗氧化酶(SOD和catalase)含量，觀察尼克酰胺對缺氧心肌細胞的抗氧化效應。ATP，NAD+和NADP+含量進一步用以檢測能量生成；線粒體膜電位用以評估線粒體自穩(wěn)。
　　 二、主要結果與結論
　　 1.在常氧條

7、件下，尼克酰胺減少心肌細胞死亡呈劑量依賴關系(細胞死亡評估通過檢測RIP和CC3蛋白表達)，但作用濃度為10mM的尼克酰胺預處理16h沒有改變常氧細胞中LDH釋放和ATP含量。另外，尼克酰胺明顯增加細胞內NAD+和NADP+水平。這些數(shù)據(jù)提示尼克酰胺主要通過提供足夠的ATP合成前體減少細胞死亡。
　　 2.在缺氧條件下，尼克酰胺減少心肌細胞死亡呈劑量依賴關系。與單純缺氧組相比，10mM尼克酰胺預處理明顯降低缺氧誘導的LDH釋放和

8、TUNEL陽性細胞數(shù)。這些結果證明尼克酰胺預處理減少缺氧誘導的細胞死亡。
　　 3.尼克酰胺預處理顯著減少細胞內ROS含量、增加抗氧化酶SOD和catalase的蛋白表達，提示尼克酰胺預處理通過增加心肌細胞抗氧化能力有效地較少缺氧誘導的線粒體氧化應激。
　　 4.尼克酰胺預處理增加NAD+、ATP含量和線粒體膜電位到接近正常對照水平，而在缺氧組明顯降低?？傊?，缺氧條件下尼克酰胺預處理通過促進能量合成有效地阻止線粒體膜電位