rhGLP-1(7-36)對(duì)糖尿病合并腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、文章主要從以下幾方面進(jìn)行了論述。
　　第一部分SD大鼠2型糖尿病模型的建立。
　　目的:建立類似于人類2型糖尿病病理生理特征的大鼠糖尿病模型，為后期實(shí)驗(yàn)提供2型糖尿病動(dòng)物模型。
　　方法：采用高脂飼料喂養(yǎng)4周誘導(dǎo)胰島素抵抗，再用腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)誘導(dǎo)胰島損傷的方法建立糖尿病模型;將大鼠隨機(jī)分成普通飼料飼養(yǎng)的正常對(duì)照組，高脂飼料喂養(yǎng)的模型對(duì)照組和模型組;Lee's指數(shù)評(píng)價(jià)肥胖程度;ELI

2、SA法測(cè)定血漿胰島素(INS)，甘油三酯(TG)，總膽固醇(TC)及游離脂肪酸(FAA);血糖儀測(cè)定血糖，成模標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖≥11.0 mmol/L;SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組相比，高脂飼料組在喂養(yǎng)4周后出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗及血脂代謝紊亂，模型組給予STZ后出現(xiàn)多飲多尿，體重減輕等現(xiàn)象，以及空腹血糖升高，胰島素敏感性指數(shù)降低等生化改變;造模成功率為50％，死亡率為7.4

3、1％。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用的造模方法，成功建立了符合臨床2型糖尿病特點(diǎn)的動(dòng)物模型。
　　第二部分HPLC/MS/MS法測(cè)定大鼠腦內(nèi)EAAs含量方法學(xué)建立。
　　目的：采用HPLC/MS/MS技術(shù)建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)腦組織內(nèi)興奮性氨基酸的實(shí)驗(yàn)方法。
　　方法：采用Agilent1200型高效液相色譜系統(tǒng)和AB SCIEX QTRAP5500型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng);以HYPERSIL GOLD為預(yù)柱，R

4、estek C18為分離柱，流動(dòng)相A為0.1％甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，A∶B=40∶60等梯度洗脫;質(zhì)譜分析條件為陽(yáng)離子模式下多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），用于定量分析的GLU離子為m/z142.1→84.1，ASP離子為m/z134→74，內(nèi)標(biāo)(GLU-d5)為m/z153.1→88;采用Analyst1.5.2進(jìn)行數(shù)據(jù)定量分析，SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:GL

5、U、ASP、GLU-d5的保留時(shí)間分別為1.63 min、2.33 min、1.61 min，分離度好，峰形良好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾;在10～1000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，線性良好，r2大于0.99，定量下限為10 ng/ml; GLU和ASP的日內(nèi)精密度(RSD)分別為1.0％～11.0％和2.0％～12.0％,日間精密度(RSD)分別為4.0％～5.0％,3.0％～5.0％,準(zhǔn)確度分別為88.4％～116.0％和85.8％～116.

6、0％;在10 ng/ml、100 ng/ml、1000 ng/ml濃度下，回收率分別為0.79±0.24、1.01±0.10、0.90±0.12和0.99±0.26、0.93±0.07、1.13±0.13;GLU和ASP的稀釋效應(yīng)為11.59±2.29％和10.81±1.73％;樣本室溫條件下穩(wěn)定。
　　結(jié)論：該分析方法的特異性、線性、靈敏度、準(zhǔn)確度均符合生物樣品質(zhì)量分析要求，稀釋效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果基本無(wú)影響，在本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下可用于定

7、量檢測(cè)大鼠腦組織內(nèi)興奮性氨基酸含量。
　　第三部分 rhGLP-1(7-36)對(duì)糖尿病合并腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的：1.考察rhGLP-1(7-36)對(duì)糖尿病合并腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用療效;2.初步探討rhGLP-1(7-36)發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法：通過(guò)高脂飼料飲食加小劑量STZ誘導(dǎo)胰島損傷的方法建立SD大鼠2型糖尿病模型，再在糖尿病模型的基礎(chǔ)上建立MCAO/R模型，將糖尿

8、病合并MCAO/R模型組大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型對(duì)照組，尼莫地平組，胰島素組，rhGLP-1(7-36)低、中、高劑量組，通過(guò)觀察大鼠給藥后神經(jīng)功能缺損評(píng)分改善程度，TTC染色后各組大鼠腦梗死面積，以及HE染色觀察各組大鼠腦組織病理形態(tài)改變來(lái)評(píng)價(jià)rhGLP-1(7-36)的腦保護(hù)作用;測(cè)定各組大鼠給藥后30 min血糖變化，來(lái)評(píng)價(jià)rhGLP-1(7-36)的降糖療效;通過(guò)ELISA法測(cè)定腦組織內(nèi)SOD、MDA、GSH-PX、iNOS、

9、eNOS含量變化，HPLC/MS/MS法來(lái)測(cè)定腦組織內(nèi)GLU、ASP含量變化來(lái)探討rhGLP-1(7-36)發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制;用SPSS16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.rhGLP-1(7-36)對(duì)糖尿病合并MCAO/R大鼠神經(jīng)功能評(píng)分影響
　　手術(shù)成功大鼠出現(xiàn)偏癱癥狀，與模型對(duì)照組比較，尼莫地平組、胰島素組、rhGLP-1(7-36)中、高劑量組在數(shù)值上均有改善神

10、經(jīng)功能缺損狀態(tài)的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.rhGLP-1(7-36)對(duì)腦梗死面積影響
　　與模型對(duì)照組比較（vs.31.90±7.86％），尼莫地平組（21.10±19.82％，P＜0.05）、胰島素組（14.68±11.58％，P＜0.05）、rhGLP-1(7-36)中劑量組（13.54±8.64％，P＜0.01）、高劑量組（16.97±15.74％，P＜0.01）均能減少腦梗死面積;rhGLP

11、-1(7-36)各組與尼莫地平組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.rhGLP-1(7-36)對(duì)腦組織病理影響
　　rhGLP-1(7-36)各組與模型對(duì)照組相比，腦組織水腫空泡數(shù)量明顯減少，尼氏小體數(shù)目增多，排列更加規(guī)律，緊密，血管增生增加。
　　4.rhGLP-1(7-36)對(duì)血糖的影響
　　與模型對(duì)照組相比，rhGLP-1(7-36)高劑量組給藥后30 min血糖下降最顯著（P＜0.01），與胰

12、島素組比較，rhGLP-1(7-36)低劑量組血糖下降程度低（P＜0.01），中、高劑量組與胰島素組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.rhGLP-1(7-36)對(duì)腦組織內(nèi)SOD、MDA、GSH-PX、iNOS、eNOS的影響
　　與模型對(duì)照組比較，rhGLP-1(7-36)中、高劑量組腦組織內(nèi)SOD活性顯著增加（P＜0.01），與尼莫地平組比較，rhGLP-1(7-36)中、高劑量組增高更顯著(P＜0.05，P＜0.01);rhG

13、LP-1(7-36)低、中、高劑量組GSH-PX活性較模型對(duì)照組升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，較尼莫地平組升高更顯著（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）;rhGLP-1(7-36)低、中、高劑量組較模型對(duì)照組，MDA含量降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），較尼莫地平組rhGLP-1(7-36)高劑量組下降更為明顯(P＜0.01); rhGLP-1(7-36)低、中、高劑量組較模型對(duì)照組，iNOS

14、活性降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），較尼莫地平組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;rhGLP-1(7-36)高劑量組較模型對(duì)照組，eNOS活性升高(P＜0.05)。
　　6.rhGLP-1(7-36)對(duì)腦組織內(nèi)興奮性氨基酸含量的影響
　　與模型對(duì)照組比較，rhGLP-1(7-36)中、高劑量組腦組織內(nèi)GLU含量降低（P＜0.05，P＜0.05），與尼莫地平組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型對(duì)照組比較，胰島素組ASP含量下降最為

15、明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.rhGLP-1(7-36)能改善糖尿病合并腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損狀況，減輕腦組織損傷，對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。
　　2.rhGLP-1(7-36)能夠降低血糖，從而達(dá)到治療糖尿病的作用。
　　3.rhGLP-1(7-36)能夠增加腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織內(nèi)SOD、GSH-PX、eNOS活性，降低iNOS活性，降低MDA、GLU含量，從