Caveolin-1對3T3-L1細(xì)胞生長的影響及其在胰島素信號通路中的作用.pdf

1、目的:Caveolin-1基因?qū)?T3-L1細(xì)胞生長特性影響及其在胰島素信號通路中的作用機(jī)制。
　　方法:將攜帶有CAV1全長片段(CAV1)、 CAV1沉默的CAVRNAi載體分別轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞并通過相應(yīng)的生物素抗性標(biāo)記篩選建立穩(wěn)定細(xì)胞株;用Western-Blot檢測各組CAV1蛋白的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞所處的周期;用免疫熒光法觀測胰島素刺激前后胰島素通路中相關(guān)蛋白 CAV1、GLUT4、IR蛋白的表達(dá)情況。用Wes

2、tern-Blot檢測CAV1、GLUT4、IR蛋白的定位和表達(dá)情況,探討CAV1在胰島素信號通路中的作用。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)/NT-GFP-CAV1的3T3-L1細(xì)胞其CAV1的表達(dá)明顯強(qiáng)于其他各組(P<0.05);轉(zhuǎn)染CAV1 Lentiviral RNAi組CAV1的表達(dá)明顯低于其他各組(P<0.05),3T3組與GFP組無明顯差別(P>0.05)
　　流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,CAV1-GFP組G0

3、/G1期細(xì)胞比例明顯升高,而G2/M期細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05),RNAi組G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低,而G2/M期細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05),而空載體組和正常3T3細(xì)胞組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　分別用0MU/L、10MU/L及300MU/L RI處理6 h后熒光顯微鏡下觀察Caveolin-1及 IR的表達(dá)。熒光顯微鏡下觀察:CAV1、3T3、GFP組 CAV1及RI呈現(xiàn)紅色熒光,RNAi組中CAV

4、1為綠色熒光,散在的分布在胞質(zhì)中?？偟膩砜?CAV1組熒光強(qiáng)度最強(qiáng),3T3組及GFP組居中,RNAi組熒光強(qiáng)度最弱。除RNAi組外,其余三組細(xì)胞其熒光強(qiáng)度均隨RI的濃度升高而增強(qiáng),在RI濃度為300MU/L時,熒光強(qiáng)度最強(qiáng),這種趨勢在CAV1組最顯著,GFP組及3T3組不明顯,而RNAi組無這種趨勢。
　　四個組別的對數(shù)生長期細(xì)胞分別用0MU/L及300MU/L濃度RI處理6 h后,收集蛋白,Wsetern-Blot檢測細(xì)胞CAV

5、1、IR、GLUT4蛋白的表達(dá)。CAV1、3T3、GFP組予以 RI300MU/L處理后 CAV1蛋白的表達(dá)明顯強(qiáng)于無 RI處理組(P<0.05),RNAi組此差別不明顯(P>0.05)。且CAV1蛋白的表達(dá)在CAV1組強(qiáng)度最強(qiáng),3T3組及GFP組居中,RNAi強(qiáng)度最弱(P<0.05)。IR蛋白及GLUT4的表達(dá)亦符合上述規(guī)律。
　　結(jié)論:1、成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)CAV1基因全長的3T3-L1細(xì)胞系,成功建立CAV1基因沉默的3T