Apelin對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　胰島素抵抗（Insulin resistance,IR）是機體對胰島素的作用不敏感的一種病理狀態(tài)，是多種疾病的“共同土壤”。胰島素抵抗是代謝綜合征最核心的發(fā)病機制，它不僅可以導致2型糖尿病，還可以導致高血壓，血脂紊亂，動脈粥樣硬化等多種心血管系統(tǒng)疾病。
　　Apelin是血管緊張素受體樣受體APJ的內(nèi)源性配體，主要由脂肪細胞分泌。Apelin及其受體APJ在全身多個系統(tǒng)，包括心血管，下丘腦，胃腸道，皮膚，肌肉

2、，乳腺和胎盤等，發(fā)揮著多種不同的生物學效應。研究發(fā)現(xiàn)，在新診斷的2型糖尿病病人中，apelin的水平是上升的，但是，在進展期的2型糖尿病病人中，apelin的水平卻是降低的；另外，小鼠腹腔注射apelin后，在血糖下降的同時，血漿胰島素的水平也出現(xiàn)了下降，雖然其中的機制還未完全闡明，但是，這都提示我們，apelin和胰島素抵抗以及機體糖代謝密切相關(guān)。近期研究證實，在分離的胰島素抵抗骨骼肌細胞中，apelin能增加葡萄糖攝取。但是，ape

3、lin作為脂肪因子，其對脂肪細胞，特別是胰島素抵抗的脂肪細胞的有何作用，目前尚無相關(guān)文獻報道。
　　研究目的：
　　1、Apelin對于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取的作用。
　　2、Apelin對于胰島素敏感性的作用，以及對于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖攝取的作用。
　　3、Apelin能否改善胰島素抵抗時低度炎癥狀態(tài)。
　　4、Apelin增加葡萄糖攝取，改善胰島素抵抗的可能機制。<

4、br>　　研究方法：
　　1、誘導3T3-L1前脂肪細胞分化成為成熟脂肪細胞，并通過油紅O染色鑒定。
　　2、用TNF-α建立胰島素抵抗脂肪細胞模型，并通過葡萄糖攝取實驗鑒定。
　　3、通過葡萄糖攝取實驗觀察apelin對IR脂肪細胞糖攝取的作用，研究apelin是否能直接增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的攝取，是否能通過增加胰島素敏感性，間接增加葡萄糖攝取。
　　4、用過RT-PCR檢測相關(guān)炎癥因子m

5、RNA表達，通過western blotting分析相關(guān)信號通路蛋白表達，明確apelin作用于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞可能的機理。
　　5、通過免疫細胞化學方法觀察葡萄糖轉(zhuǎn)運體4（GLUT4）膜轉(zhuǎn)位，通過western blotting檢測GLUT4膜蛋白表達，明確GLUT4在apelin作用于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞中的作用。
　　實驗結(jié)果：
　　1、3T3-L1前脂肪細胞接觸抑制后，通過地塞米松，異丁

6、基甲基黃嘌呤，胰島素混合誘導劑誘導8-12天，3T3-L1前脂肪細胞分化成為成熟脂肪細胞。油紅O染色后證實85％以上3T3-L1前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞。
　　2、在成熟的脂肪細胞中，10ng/mlTNF-α作用24h后，通過葡萄糖攝取實驗證實：TNF-α作用組脂肪細胞對胰島素刺激的葡萄糖攝取降低47％（P<0.05），細胞產(chǎn)生胰島素抵抗。
　　3、通過不同劑量apelin（10nM，102nM，103nM，104nM）

7、apelin作用于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞60分鐘，及103nMapelin作用于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞15分鐘，30分鐘，60分鐘，120分鐘，240分鐘，葡萄糖攝取實驗證實：apelin呈時間及濃度依賴型增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的攝取(P<0.05 102nM apelin versus control; P<0.01 103nM apelin versus control)，(P<0.01 60mi

8、n versus control, P<0.05 120min versus control)，(P<0.05 103nM apelin versus 102nM apelin)。
　　4、通過葡萄糖攝取實驗證實：102nM及103nMapelin預處理60分鐘后，胰島素刺激的葡萄糖攝取顯著增加，103nMapelin對葡萄糖攝取具有更顯著的效應。Apelin能增強胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞對胰島素的敏感性(P<0.05 10

9、2nM apelin versus insulin, P<0.01 103nM apelin versus insulin, P<0.05 103nM apelin versus 102nM apelin)。
　　5、在100nMPI3K/Akt的特異性抑制劑渥曼青霉素作用30分鐘后，apelin增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取的作用顯著降低(P<0.05 versus 100 nM wort, P<0.01 vers

10、us 100 nM wort)。同時，通過Western blotting實驗證實100nM渥曼青霉素作用30分鐘后，磷酸化Akt的水平降低。證實apelin增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的攝取是通過PI3K/Akt通路。
　　6、通過細胞爬片后經(jīng)免疫細胞化學證實：apelin增加葡萄糖攝取是通過促進GLUT4從胞漿向胞膜轉(zhuǎn)位實現(xiàn)的。同時，Western blotting實驗檢測膜蛋白GLUT4也證實，apelin能增

11、加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的GLUT4膜轉(zhuǎn)位。
　　7、提取細胞mRNA，經(jīng)RT-PCR實驗證實apelin能增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞抗炎因子adiponectin mRNA表達，降低炎癥因子IL-6mRNA表達(P<0.01 versus untreated)。Apelin能調(diào)節(jié)胰島素抵抗細胞的炎癥反應。
　　結(jié)論：
　　1、Apelin呈時間及濃度依賴型增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的攝