雌激素對絕經前后女性腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa作用的研究.pdf

1、目的：原發(fā)性高血壓病是嚴重危害人類健康的常見病之一,主要表現為小動脈和微動脈張力的增加,血管壁不能對抗血管緊張度增高以及對血管活性物質的反應性出現異常,臨床表現為血壓的持續(xù)增高;人體腸系膜血管是人體主要的內臟血管,在動脈中占有較大比例,而且是形成外周阻力的主要動脈,對血管活性物質敏感,對人體血壓的調節(jié)具有舉足輕重的作用;大電導鈣激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium cha

2、nnels,BKCa)是動脈平滑肌上主要的負反饋調節(jié)器,在血管的舒縮調節(jié)中發(fā)揮著重要作用。雌激素(estrogen, E)是女性體內重要的激素之一,具有很多的生物學效應。流行病學調查顯示,原發(fā)性高血壓病具有明顯的性別差異,絕經前婦女原發(fā)性高血壓的發(fā)病率明顯低于同齡的男性發(fā)病率,但在女性絕經后則不存在這樣的差異。研究顯示,雌激素在女性心血管功能正常的維持和調節(jié)方面具有重要的意義,其機制有可能與通過雌激素受體(Estrogen Recept

3、or, ER)調節(jié)其動脈平滑肌的結構和功能有關,但具體機制尚不明確。本實驗采用穿孔全細胞膜片鉗技術,通過觀察絕經前后女性腸系膜動脈血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)BKCa宏觀電流及自發(fā)性瞬時外向電流(spontaneous transient outward currents, STOCs),并研究E對絕經前女性非高血壓(pre-menopause women non-hypert

4、ension,PNH)組、絕經后女性非高血壓(post-menopause women non-hypertension, NH)組及絕經后女性原發(fā)性高血壓(post-menopause women essential hypertension, EH)組腸系膜動脈平滑肌細胞上BKCa及STOCs敏感性變化,探討E、BKCa與女性原發(fā)性高血壓病之間的關系,為E對女性心血管系統(tǒng)的保護作用提供實驗依據。方法：在體式顯微鏡下,游離出腸系膜動脈

5、,并縱向剖開剪成2 mm×2 mm×1 mm的動脈條塊,放在酶液中進行兩步酶消化。選取表面光滑、折光性好、立體感強的平滑肌細胞進行實驗。采用穿孔全細胞膜片鉗技術記錄通道電流。記錄到的電流信號經過膜片鉗放大器放大,經過 AD/DA轉換器處理后輸入計算機,采用Clampfit10.1、MiniAnalysis6.0、OriginPro8.0軟件進行數據分析處理統(tǒng)計。比較絕經前PNH組、絕經后NH組和EH組應用E前后BKCa宏觀電流及STOC

6、s的變化。結果：(1)采用兩步急性酶法分離的女性腸系膜動脈平滑肌細胞 BKCa宏觀電流和STOCs的基本特性:①BKCa宏觀電流具有明顯的電壓依賴性和外向整流特性;STOCs的幅度和頻率具有顯著的電壓依賴性,并隨機疊加在BKCa宏觀電流上。②200 nM的BKCa特異性阻斷劑Iberiotoxin(IbTX)可明顯抑制宏觀外向電流以及阻斷STOCs。(2)絕經前女性PNH組BKCa宏觀電流及STOCs對雌激素反應性變化:雌激素可顯著激活

7、PNH組上BKCa宏觀電流和STOCs。在測試電壓0mV到+60mV范圍,100μM E可顯著性激活BKCa宏觀電流,在0 mV和+60 mV時其電流密度分別從1.98±0.39 pA/pF、16.43±4.90 pA/pF增加到4.45±1.25 pA/pF(P<0.05,n=7)、32.36±6.86 pA/pF(P<0.01,n=7);電位為-20mV時,STOCs的幅度和頻率分別從8.98±2.56 pA、3.05±0.84 H

8、z增加到16.88±3.90 pA(P<0.05,n=7)、5.26±1.46 Hz(P<0.01,n=7)。(3)絕經后女性NH組BKCa宏觀電流及STOCs對雌激素反應性變化:雌激素可顯著激活NH組上BKCa宏觀電流和STOCs。在測試電壓0mV到+60mV范圍,100μM E可顯著性激活BKCa宏觀電流,在0mV和+60 mV時其電流密度分別從1.99±0.41 pA/pF、15.89±4.87 pA/pF增加到3.26±1.32

9、 pA/pF(P<0.05,n=23)、27.88±6.75 pA/pF(P<0.01,n=23);電位為-20mV時,加入100μM E后,STOCs的幅度和頻率分別從8.56±2.43 pA、2.98±0.77 Hz增加到14.75±3.78 pA(P<0.05,n=23)、4.70±1.57Hz(P<0.01,n=23)。(4)絕經后女性EH組BKCa宏觀電流及STOCs對雌激素的反應性變化:EH組在測試電壓-60mV到+50 m

10、V范圍,100μM E對BKCa宏觀電流沒有顯著性激活作用,僅僅在+60mV時有統(tǒng)計學差異。在0mV和+60mV時其電流密度分別從1.35±0.44 pA/pF、4.48±1.47 pA/pF增加到1.48±0.55 pA/pF(P>0.05,n=17)、7.17±2.47 pA/pF(P<0.05,n=17);在電位為-20mV時,加入100μM E后,STOCs的幅度和頻率分別從5.67±1.73 pA、1.28±0.43 Hz增加

11、到6.58±1.34 pA(P>0.05,n=17)、1.90±0.99 Hz(P<0.05,n=17)。(5)PNH組、NH組和EH組對雌激素反應性變化的比較:①在+60 mV時,絕經前PNH組加入100μM E后,BKCa電流密度增加了0.97±0.40倍,電位為-20mV時,STOCs的幅度和頻率分別增加了0.88±0.43倍和0.72±0.39倍。②絕經后NH組加入100μM E后,BKCa電流密度增加了0.75±0.47倍,電

12、位為-20mV時,STOCs的幅度和頻率分別增加了0.72±0.32倍和0.58±0.34倍。③在+60 mV時,EH組加入100μM E后,BKCa的電流密度增加了0.60±0.33倍;電位為-20mV時,STOCs幅度和頻率分別增加了0.16±0.11倍和0.48±0.30倍。(6)雌激素受體抑制劑ICI182780對女性腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa宏觀電流及STOCs的作用:在+60 mV時,加入100μM E后,BKCa電流密度

13、從15.89±4.87 pA/pF增加到27.88±6.75 pA/pF(P<0.01,n=23);在此基礎上加入100μM ICI182780后,其電流密度降低到20.15±6.21 pA/pF(P<0.05,n=23);電位為-20mV時,加入100μM E后,STOCs的幅度和頻率分別從8.56±2.43 pA、2.98±0.77 Hz增加到14.75±3.78 pA(P<0.05,n=23)、4.70±1.57Hz(P<0.01

14、,n=23),在此基礎上加入100μM ICI182780后,STOCs的幅度和頻率分別降低到10.87±3.45pA(P<0.05,n=23)和3.52±0.98 Hz(P<0.05,n=23)(7)一氧化氮合酶抑制劑L-NAME對女性腸系膜動脈平滑肌細胞BKCa宏觀電流及STOCs的作用:加入100μM E15min后,BKCa宏觀電流明顯被激活,在+60mV時,BKCa電流密度從17.52±4.25增加到25.83±5.27 pA

15、/pF(P<0.05,n=4),在此基礎上加入600μM一氧化氮合酶抑制劑L-NAME,該電流明顯被抑制,BKCa電流密度降低到14.25±3.57 pA/pF(P<0.05,n=4);電位為-20mV時,加入100μM E15min后,STOCs的幅度和頻率分別從7.24±3.27 pA和2.04±0.74 Hz增加到9.85±2.62 pA(P<0.05,n=4)和2.25±0.65 Hz(P<0.05,n=4),在此基礎上加入60

16、0μM一氧化氮合酶抑制劑 L-NAME,其幅度和頻率分別降低到6.24±1.86 pA(P<0.05,n=4)和1.65±0.54 Hz(P<0.05,n=4)。結論：(1)女性腸系膜動脈平滑肌細胞 BKCa宏觀電流具有明顯的電壓依賴性和外向整流特性;由 BKCa介導的STOCs的幅度和頻率具有顯著的電壓依賴性和隨機性。(2)雌激素可激活絕經前女性PNH組、絕經后女性NH組和EH組腸系膜動脈平滑肌細胞 BKCa宏觀電流及STOCs的幅度

17、和頻率,且 PNH組和NH組對雌激素反應性比較,NH組較PNH組低,提示E對絕經前女性的血管有一定的保護作用;絕經后女性NH組和EH組對雌激素反應性比較,EH組較NH低,提示高血壓后,血管對雌激素的反應性下降,絕經可能是高血壓發(fā)生發(fā)展的一個因素。(3)雌激素可引起女性腸系膜血管舒張,且雌激素受體特異性抑制劑 ICI182780能部分抑制該舒張效應,提示 BKCa和ER參與了雌激素舒張腸系膜血管的機制。(4)一氧化氮合酶抑制劑 L-NAM