AngⅡ?qū)Ω哐獕夯颊吣c系膜動脈血管平滑肌細(xì)胞BKCa的影響及與AT2R表達(dá)的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:高血壓(hypertension,HT)是危害人類健康的心血管常見病和多發(fā)病,其基本病理特征是阻力動脈的張力持續(xù)增加。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)上的離子通道參與了血管張力的調(diào)節(jié),其中大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large conductancecalcium—activated potassium channels,BKCa)的開放是血管平滑肌舒張的重要機(jī)制,呈現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)方式。

2、血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)作為一種有效的內(nèi)源性縮血管活性物質(zhì),通過血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensinⅡ type1 receptor,AT1R)發(fā)揮收縮血管的作用；然而近年來卻發(fā)現(xiàn),AngⅡ可以舒張腸系膜動脈。研究證實(shí)AngⅡ通過作用于血管緊張素Ⅱ2型受體(angiotensinⅡ type2 receptor,AT2R),引起B(yǎng)KCa的開放,導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化,進(jìn)而舒張腸系膜動脈。這樣就提出了一個關(guān)于A

3、ngⅡ的非內(nèi)皮依賴的血管舒張作用的新觀點(diǎn),它對我們深入理解高血壓的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制有重要的意義。因此,探討在高血壓的情況下,AT2R表達(dá)的變化以及由此是否引起B(yǎng)KCa對AngⅡ反應(yīng)性的改變是有必要的。本實(shí)驗(yàn)采用單通道膜片鉗技術(shù)和免疫印跡法(Western blot),探討AngⅡ的作用機(jī)制及其與AT2R和高血壓之間的關(guān)系,為闡明其擴(kuò)張腸系膜動脈的機(jī)制及AT2R的血管保護(hù)性作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:(1)單通道膜片鉗實(shí)驗(yàn):21

4、例接受腹部手術(shù)的患者分為兩組:高血壓(HT組)未長期規(guī)律服用抗高血壓藥的8例、正常血壓(NT組)13例,分離其腸系膜動脈,縱向剖開剪成2 mm×2mm的組織條塊,置于酶液中進(jìn)行兩步消化。選取立體感較強(qiáng),表面光滑的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),在對稱性高鉀溶液中,采用膜片鉗細(xì)胞貼附式和內(nèi)面向外式記錄BKca電流。電流信號經(jīng)膜片鉗放大器CEZ-2200放大,濾波處理后輸入計算機(jī),經(jīng)pClamp6.0軟件采集電流,Clampfit10.1軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)

5、據(jù)分析。血管平滑肌細(xì)胞先經(jīng)AT1R阻斷劑纈沙坦10μM預(yù)處理10分鐘后,分別觀察在細(xì)胞貼附式和內(nèi)面向外式膜片下AngⅡ?qū)KCa的作用,比較AngⅡ?qū)T組和HT組BKCa電流的作用及AT2R是否介導(dǎo)了AngⅡ?qū)KCa的激活。(2)Western blot檢測AT2R的蛋白水平:27例接受腹部手術(shù)的患者分為兩組:高血壓(HT組)14例(其中未長期規(guī)律服用抗高血壓藥的6例,長期規(guī)律服用抗高血壓藥的8例)、正常血壓(NT組)13例,取其切

6、除的腸系膜動脈加入裂解液提取總蛋白,BCA法測定提取的蛋白濃度。每孔上樣蛋白量為30μg,選擇合適電壓進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)印。用AT2R兔抗人單克隆抗體(1:800)孵育。洗膜后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1:5000)進(jìn)行孵育。凝膠圖像用Quantity One軟件分析,其中AT2R蛋白的表達(dá)水平用GAPDH蛋白的表達(dá)量來校正。
　　 結(jié)果:(1)急性酶分離的人腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞BKCa單通道電流的特

7、性:①BKCa單通道電流具有較高的電導(dǎo),其電導(dǎo)值為220.10±10.90 pS(11=11)。②通道具有明顯的電壓依賴性和鈣離子濃度依賴性。③在外面向外式膜片下(Vm=+30 mV),200 nM的IbTX幾乎完全阻斷通道的活動。(2)在內(nèi)面向外式膜片下(Vm=+40 mV),AngⅡ?qū)θ四c系膜動脈平滑肌細(xì)胞BKCa的活性無明顯影響。(3)在貼附式膜片下(Vm=+40 mV),AngⅡ?qū)θ四c系膜動脈平滑肌細(xì)胞BKCa的作用:①在NT組

8、,AngⅡ?qū)KCa有明顯的激活作用:通道開放概率由0.072±0.022增至0.224±0.054(n=13,P<0.05),平均開放時間由7.850±2.001ms增至30.701±8.316 ms(n=13,P<0.05)；通道平均關(guān)閉時間雖有減少,但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后無顯著差異；電流幅值用藥前后無明顯變化。②在HT組(未長期規(guī)律服用抗高血壓藥),AngⅡ?qū)KCa的活性無明顯影響。③在NT組,AngⅡ激活BKCa后,加入AT2R阻斷

9、劑PD123,319,BKCa被抑制:開放概率由0.391±0.112減至0.120±0.087(n=5,P<0.05),平均開放時間由8.947±2.107 ms減至1.738±0.238 ms(n=5,P<0.05),平均關(guān)閉時間由12.952±3.426 ms增至48.339±10.481 ms(n=5,P<0.05),電流幅值用藥前后無明顯變化。(4)在NT組,HT組(未長期規(guī)律服用抗高血壓藥)和HT組(長期規(guī)律服用抗高血壓藥)

10、的腸系膜動脈AT2R蛋白的相對表達(dá)量分別為1.2046±0.0564(n=13),0.9893±0.0543(n=6)和1.3197±0.0491(n=8)。NT組的AT2R蛋白表達(dá)水平高于HT組(未長期規(guī)律服用抗高血壓藥)(P<0.05),但NT組的AT2R蛋白表達(dá)水平與HT組(長期規(guī)律服用抗高血壓藥)無明顯差異(P>0.05),HT組(長期規(guī)律服用抗高血壓藥)的AT2R蛋白表達(dá)水平高于HT組(未長期規(guī)律服用抗高血壓藥)(P<0.05

11、)。
　　 結(jié)論:(1)在內(nèi)面向外式膜片上,AngⅡ?qū)θ四c系膜動脈平滑肌細(xì)胞BKCa的活性無明顯影響。(2)在細(xì)胞貼附式膜片上,AngⅡ?qū)ρ獕赫；颊吣c系膜動脈平滑肌細(xì)胞BKCa有激活作用,且這種作用是通過AT2R介導(dǎo)的；但AngⅡ?qū)Ω哐獕夯颊?未長期規(guī)律服用抗高血壓藥)腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞BKCa活性無明顯影響。(3)在高血壓狀態(tài)下,AT2R蛋白的表達(dá)是下調(diào)的,經(jīng)過長期規(guī)律的抗高血壓治療后,AT2R蛋白的表達(dá)得以恢復(fù)。正是由于