血管緊張素Ⅱ通過(guò)NF-κB上調(diào)巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 臨床證據(jù)和病理學(xué)研究均表明,急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome ACS)發(fā)病的病理機(jī)制為動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的破裂。易損斑塊在病理上表現(xiàn)為較薄的纖維帽和較大的脂質(zhì)核心,其斑塊肩部浸潤(rùn)了豐富的巨噬-泡沫細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloproteinases,MMPs)。如何檢測(cè)及防治易損斑塊是ACS治療中的關(guān)鍵,國(guó)際多中心大型臨床隨機(jī)實(shí)驗(yàn)研究顯示:血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(AC

2、EI)能夠顯著降低心血管高危人群心肌梗死的發(fā)生率。然而其內(nèi)在機(jī)制不清楚。ACEI對(duì)心血管的保護(hù)作用源于對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ AngⅡ)的抑制。AngⅡ作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性肽,可通過(guò)致炎癥、誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)等作用加劇動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。
　　 由于易損斑塊破裂的主要原因?yàn)楣跔顒?dòng)脈的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解,而MMP是降解易損斑塊內(nèi)ECM的主要活性酶,所

3、以對(duì)MMPs在致易損斑塊破裂中的研究愈發(fā)深入。但MMPs有多個(gè)家族成員分子,探討其一種成員分子不可能詮釋易損斑塊形成和破裂的機(jī)制,試驗(yàn)也證實(shí)單一MMPs抑制劑臨床應(yīng)用沒(méi)有給冠心病患者帶來(lái)益處。最近研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrixmetalloproteinase inducer,EMMPRIN)參與了許多MMP成員的從頭合成,2002年Major等發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中有EMMPRIN表

4、達(dá),并參與了動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展,越來(lái)越多的證據(jù)表明EMMPRIN參與了動(dòng)脈硬化病變過(guò)程。
　　 導(dǎo)師的前期系列研究結(jié)果顯示AngⅡ能通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的MMPs的表達(dá),參與了最終的斑塊破裂過(guò)程。但AngⅡ與MMPs誘導(dǎo)因子EMMPRIN是否存在聯(lián)系尚未見(jiàn)報(bào)道,因此本研究通過(guò)AngⅡ體外刺激巨噬細(xì)胞,觀察EMMPRIN的表達(dá)變化情況,并評(píng)價(jià)了NF-κB通路在這一調(diào)控過(guò)程中的作用。
　

5、　 方法
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)及鑒定
　　 人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞采用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106/L,加PMA(50μg/L)于培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)入6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h,使懸浮細(xì)胞分化為貼壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞。使用流式細(xì)胞術(shù)鑒定巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)情況。細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.分組刺激及指標(biāo)檢測(cè):
　　 誘導(dǎo)成功后的巨噬細(xì)胞使用PBS清洗3次徹底清除PMA。更換10

6、％胎牛血清的RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)。使用AngⅡ分別以濃度梯度(1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L)和時(shí)間梯度(6、12、24 h)刺激巨噬細(xì)胞,使用AT1R拮抗劑厄貝沙坦、AT2R拮抗劑PD123319、NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理細(xì)胞,檢測(cè)對(duì)AngⅡ刺激EMMPRIN表達(dá)的影響。收集細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)EMMPRIN mRNA表達(dá);使用Westemblot檢測(cè)EMMPRIN蛋白表達(dá)。

7、r>　　 3.RNA干擾技術(shù)沉默NF-κB p65亞基表達(dá)
　　 經(jīng)驗(yàn)證有效的p65siRNA干擾序列成功轉(zhuǎn)染入THP-1細(xì)胞。6小時(shí)后使用熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot和EMSA檢測(cè)干擾效果。
　　 4.凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)EMSA檢測(cè)NF-κB與DNA結(jié)合效率
　　 上述處理的細(xì)胞使用核蛋白提取液AB液提取核蛋白,Lowry's法測(cè)定蛋白含量。分組上樣在8％在非變性的聚

8、丙烯凝膠電泳上分離,檢測(cè)各組NF-κB與DNA結(jié)合活性。
　　 5.取等量的各處理組細(xì)胞在的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,收集上清液。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白濃度,等量上樣行明膠電泳,凝膠依次行洗脫、染色,脫色,檢測(cè)MMP-9位于藍(lán)色背景上的透亮帶(92 KD)。
　　 結(jié)果
　　 1.THP-1巨噬細(xì)胞成功建立
　　 THP-1細(xì)胞為圓形懸浮細(xì)胞,經(jīng)PMA誘導(dǎo)后形狀變得不規(guī)則并伸出偽足的貼

9、壁細(xì)胞。更為重要的是誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)CD14。使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面表達(dá)CD14鑒定THP-1誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞。結(jié)果示THP-1經(jīng)PMA誘導(dǎo)48小時(shí)后,細(xì)胞表面CD14表達(dá)較未分化組高表達(dá)。
　　 2.AngⅡ刺激巨噬細(xì)胞后EMMPRIN表達(dá)上調(diào)
　　 THP-1誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞成功后,分別以劑量和時(shí)間梯度使用AngⅡ刺激巨噬細(xì)胞,觀察EMMPRIN mRNA和蛋白表達(dá)情況。由于在PMA對(duì)THP-1的誘導(dǎo)過(guò)

10、程中能引起EMMPRIN的表達(dá),巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功后徹底去除PMA,PBS沖洗細(xì)胞3遍,并繼續(xù)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細(xì)胞數(shù)小時(shí)。
　　 以AngⅡ(1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L)4個(gè)濃度刺激巨噬細(xì)胞后6h,分別以RT-PCR和Western blot檢測(cè)EMMPRIN mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示AngⅡ?qū)MMPRIN的上調(diào)有劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　 以AngⅡ(1×10-6mol/L)刺激

11、巨噬細(xì)胞,分3個(gè)時(shí)相點(diǎn)檢測(cè)EMMPRIN表達(dá)。結(jié)果顯示相對(duì)于未刺激組,AngⅡ能在6 h引起EMMPRIN表達(dá)上調(diào),并持續(xù)24 h。
　　 3.AT1R拮抗劑厄貝沙坦、AT2R拮抗劑PD123319于AngⅡ刺激細(xì)胞前30min預(yù)處理細(xì)胞,以AngⅡ(1×10-6mol/L)刺激細(xì)胞,6小時(shí)后收集檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞EMMPRINmRNA及蛋白表達(dá),結(jié)果顯示厄貝沙坦組EMMRPRIN表達(dá)量較正常AngⅡ刺激組明顯降低,而PD1

12、23319無(wú)明顯變化。結(jié)果顯示AngⅡ通過(guò)ATIR調(diào)控EMMPRIN的表達(dá)。
　　 4.AngⅡ上調(diào)EMMPRIN的表達(dá)有NF-κB通路的參與
　　 采用NF-κB抑制劑PDTC處理和NF-κ3亞基p65 RNA干擾的方法檢測(cè)NF-κB通路在AngⅡ上調(diào)EMMPRIN的表達(dá)中的作用。
　　 成功建立NF-κB亞基p65 RNA干擾模型。熒光顯微鏡檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染效率,隨機(jī)選取THP-1巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染照片,根據(jù)細(xì)胞

13、計(jì)數(shù),其轉(zhuǎn)染率平均值＞70％.
　　 p65干擾效率由Western blot檢測(cè):結(jié)果顯示相對(duì)于其他對(duì)照組,p65干擾組p65的表達(dá)明顯下降。
　　 EMSA應(yīng)用于檢測(cè)NF-κB的轉(zhuǎn)錄結(jié)合活性。使用TNF-α處理過(guò)的巨噬細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示AngⅡ能夠誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NF-κB活性,這一過(guò)程在NF-κB p65干擾組被抑制。
　　 通過(guò)EMMPRIN RT-PCR和Western blot檢測(cè)NF

14、-κB通路對(duì)AngⅡ上調(diào)EMMPRIN表達(dá)的影響。結(jié)果顯示在NF-κB抑制劑預(yù)處理組和p65干擾組,AngⅡ?qū)奘杉?xì)胞上調(diào)EMMPRIN的表達(dá)作用受到抑制。
　　 5.MMP-9活性變化與EMMPRIN表達(dá)變化一致
　　 選取上述各組刺激細(xì)胞提取上清液,行明膠酶譜法檢測(cè)MMP-9活性。結(jié)果顯示:AngⅡ刺激THP-1巨噬細(xì)胞后,MMP-9活性增高。在AT1R拮抗劑厄貝沙坦、NF-κB抑制劑PDTC及干擾NF-κB P65