K-ras基因在結(jié)直腸癌原發(fā)灶和對應(yīng)肝轉(zhuǎn)移灶突變情況的對比研究.pdf

1、1.研究背景與目的
　　 結(jié)直腸癌是全世界的第三大常見腫瘤,每年新發(fā)病例超過1000000例。在美國,結(jié)直腸癌每年約有15.4萬新發(fā)病例及5.6萬患者死亡,占癌癥死因第2位。在我國,結(jié)直腸癌的發(fā)病率平均水平居全部惡性腫瘤的第4位,發(fā)病率每年遞增4.2％,而且發(fā)病年齡明顯提前,與20世紀(jì)70年代相比,在90年代城市的發(fā)病率上升了31.95％,農(nóng)村上升了8.51％。2006年中國衛(wèi)生統(tǒng)計提示大腸癌病死率位居惡性腫瘤第5位。據(jù)文獻(xiàn)報道

2、,肝是結(jié)直腸癰最常見的轉(zhuǎn)移部位。當(dāng)結(jié)直腸癌確診時,已經(jīng)有20％-25％病例發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移,而約60％的患者在其病程中會出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。治愈性根治術(shù)后再發(fā)的肝轉(zhuǎn)移率為50％；結(jié)直腸癌死亡的患者肝轉(zhuǎn)移率高達(dá)45％～71％。雖然手術(shù)切除、局部消融及立體定向放射外科是常用的治療方法,但當(dāng)原發(fā)灶不能切除或者肝功能不全時,內(nèi)科治療仍然是確實(shí)有效的重要治療手段。
　　 目前,晚期結(jié)直腸癌的治療以化療為主,過去的40年里,5-氟尿嘧啶(5-FU)一直

3、是治療結(jié)直腸癌的主流藥物,隨后亞葉酸鈣(CF)的加入及5-FU持續(xù)泵注使CRC患者的生存明顯延長。20世紀(jì)90年代后期,新的細(xì)胞毒藥物奧沙利鉑(Oxaliplatin)、伊立替康(CPT-11)等問世,CRC的近期療效和生存期均得到顯著提高；近年來分子靶向藥物貝伐單抗(Avastin)、西妥昔單抗(Cetuximab)、帕尼單抗(Panitumumab)的出現(xiàn),使CRC的治療又上了一個新的臺階。
　　 表皮生長因子受體(EGFR

4、)是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體,目前發(fā)現(xiàn)該受體家族包括4個亞型:EGFR(HER1/ErbB1),HER2(ErbB2),HER3(ErbB3),HER4(ErbB4)。有超過10多種配體可以選擇性與EGFR單體結(jié)合。配體與受體結(jié)合后,引起受體的寡聚化作用,激活受體酪氨酸激酶,然后使得受體細(xì)胞內(nèi)部分的酪氨酸殘基順式磷酸化。受體磷酸化后構(gòu)象發(fā)生改變,形成停泊位點(diǎn),以便與具有SH2(Src-homology 2)結(jié)構(gòu)域和磷酸化酪氨酸結(jié)

5、合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合,從而觸發(fā)包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)通路的信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng),在器官形成和腫瘤生長過程中的細(xì)胞增生、抑制凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等方面發(fā)揮著很重要的作用。
　　 表皮生長因子受體(EGFR)在結(jié)直腸癌中有過量表達(dá),為腫瘤治療提供了一個理想靶點(diǎn)。EGFR

6、過表達(dá)與細(xì)胞惡變、腫瘤細(xì)胞增侵襲、轉(zhuǎn)移、腫痛血管生成以及凋亡抗性密切相關(guān)。西妥昔單抗(Cetuximab)是一種重組人-鼠嵌合型IgG1型單克隆抗體,對細(xì)胞膜上的EGFR的親和力是內(nèi)源性配基的5-10倍,與EGFR結(jié)合后,能阻止內(nèi)源性配基與EGFR結(jié)合,切斷信號的傳導(dǎo)并阻斷酪氨酸激酶的磷酸化,從而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、減少基質(zhì)金屬蛋白酶和血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生,還可引起受體的二聚化、內(nèi)化和下調(diào),抑制腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。除了抑制

7、EGFR發(fā)揮抗腫瘤作用外,西妥昔單抗還能激活宿主的免疫反應(yīng),通過抗體依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC)殺傷腫瘤細(xì)胞。目前已證明用于伊立替康治療失敗的結(jié)直腸痛可提高療效。近期多項(xiàng)研究均表明:在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸痛中,K-ras野生型的患者接受西妥昔單抗聯(lián)合化療的療效、臨床獲益等均顯著優(yōu)于K-ras突變型組,強(qiáng)烈提示K-ras狀態(tài)與西妥昔單抗療效相關(guān),是獨(dú)立的西妥昔單抗療效預(yù)測指標(biāo)。只有K-ras野生型患者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗和帕尼單抗

8、(包括單藥或與化療聯(lián)合)治療。因此,K-ras基因檢測被寫入2009年版《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸痛臨床實(shí)踐指南》。也就是說,所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)檢測K-ras基因狀態(tài)。
　　 目前認(rèn)為,大腸癌的發(fā)生是機(jī)體內(nèi)因(大腸癌的遺傳易感性)和外因(飲食和環(huán)境因素)共同作用的結(jié)果。大量實(shí)驗(yàn)證明大腸癌的發(fā)生與多個癌基因的激活或抑癌基因的失活有關(guān)。Ras基因的突變被認(rèn)為在癌變過程中起啟動作用并是一個早期事件。Ras基因最初

9、是在Kirston和Hayvey大鼠肉瘤中首先發(fā)現(xiàn)的,轉(zhuǎn)導(dǎo)了ras基因的鼠纖維細(xì)胞能發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,從而確定了其癌基因的地位。Ras基因家族由K-ras、H-ras和N-ras的三個密切相關(guān)的高度同源成員組成。Ras基因定位于人類的第12號染色體上,含有4個編碼外顯子和1個5’端非編碼外顯子,共同編碼含189個氨基酸組成的ras蛋白,因其相對分子質(zhì)量為21×103,又稱為p21蛋白。K-ras的基因最常見的激活方式為點(diǎn)突變,突變主要發(fā)生在

10、1號外顯子的第12位密碼子上,偶也有發(fā)生于13位點(diǎn)及2號外顯子的61位點(diǎn)的。K-ras的基因12位密碼子野生型為甘氨酸,突變型常為半胱氨酸、纈氨酸、精氨酸三種,突變的結(jié)果導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生改變,從而產(chǎn)生具有致癌活性的p21蛋白。K-ras的基因發(fā)生異常時,鳥苷三磷酸酶(GTPase)活性降低,p21GTP牢固結(jié)合而不被GTPase水解,一直處于激活狀態(tài),持續(xù)刺激細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖,引起細(xì)胞惡變,大腸癌即可發(fā)生。另外K-ras的基因激

11、活還可以通過擴(kuò)增或過表達(dá)的方式,但發(fā)生頻率較低,多數(shù)在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。Algar等研究認(rèn)為,K-ras的基因過表達(dá),明顯降低自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)對腫瘤的殺傷作用,是大腸癌轉(zhuǎn)移,病情進(jìn)展的特征。經(jīng)研究認(rèn)為,K-ras的基因突變是在腫瘤早期形成過程中即已發(fā)生,K-ras的基因突變更賦予腫瘤極大的浸潤與轉(zhuǎn)移傾向的可能。
　　 大腸癌K-ras基因突變率在歐美約為30％-68％,而臺灣、日本人的K-ras突變率為26.5％-36.9

12、％,較歐美的檢出率偏低。Oliveira等發(fā)現(xiàn)K-ras基因的突變率在結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中比相應(yīng)的原發(fā)灶高；而Molinari等報道K-ras基因在30例結(jié)直腸癌原發(fā)灶和相關(guān)轉(zhuǎn)移灶的突變情況,有26例表達(dá)一致,一致率為86.6％；Daniele等分析99例結(jié)直腸癌原發(fā)灶和相關(guān)轉(zhuǎn)移灶的K-ras基因突變情況,其一致率96.0％；Fotios等研究43例結(jié)直腸痛原發(fā)灶和相關(guān)轉(zhuǎn)移灶的K-ras基因突變情況,一致率為95.0％。然而,原發(fā)灶

13、K-ras基因突變情況可否作為對應(yīng)肝轉(zhuǎn)移灶突變情況的預(yù)測呢?上述國外這方面的報道的研究結(jié)果不盡相同,而目前國內(nèi)缺乏相關(guān)的資料。本研究觀察了75例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶和對應(yīng)肝轉(zhuǎn)移灶中K-ras基因的突變情況,比較兩者的一致性,為選用分子靶向藥物提供新的依據(jù)。
　　 2.研究方法
　　 收集2003年1月1日至2008年5月30日佛山市第一人民醫(yī)院同期或二期手術(shù)切除所得的結(jié)直腸癌及對應(yīng)的肝轉(zhuǎn)移灶病理標(biāo)本75例。獲取病理標(biāo)木

14、時,所有患者均未接受任何分子靶向藥物治療。所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋,切成10μm厚的切片置于玻片上,應(yīng)用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit組織盒分別提取腸癌組織及對應(yīng)的肝轉(zhuǎn)移灶組織的DNA。提取的DNA經(jīng)常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增K-ras基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳純化鑒定后經(jīng)過DNA測序儀進(jìn)行測序。采用直接測序法分別檢測原發(fā)灶組織和對應(yīng)肝轉(zhuǎn)移灶組織中K-ras基因(主要檢測第12位及第13位密碼子)的突

15、變情況。數(shù)據(jù)結(jié)果以率表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行配對x2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。
　　 3.結(jié)論
　　 3.1.本研究中,原發(fā)灶K-ras基因突變率為33.3％,與亞洲的報道相近；而12密碼子的突變的主要類型為G12D(GGT→GNT)和G12V(GGT→GTT),與上述報道的相似。
　　 3.2.本研究中,原發(fā)灶與對應(yīng)肝轉(zhuǎn)移灶痛組織中K-ras基因表達(dá)情況的一致率為93.1％。因此,我們認(rèn)為,對于

16、中國人來說,在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸痛中,原發(fā)灶和對應(yīng)轉(zhuǎn)移灶的K-ras基因突變是基本一致的,原發(fā)灶K-ras的狀態(tài)可以指導(dǎo)臨床用藥,轉(zhuǎn)移灶不一定要重取活檢,或如原發(fā)灶的標(biāo)本無法獲取時,亦可取轉(zhuǎn)移灶的病理標(biāo)本進(jìn)行K-ras基因狀態(tài)檢測。這樣可以減少重復(fù)的醫(yī)療操作,減少并發(fā)癥,節(jié)省時間,降低醫(yī)療成本。
　　 3.3.當(dāng)然,要獲得更準(zhǔn)確的資料,需要更大樣本的研究以及相關(guān)蛋白表達(dá)情況的檢測和臨床病例的隨訪分析等,我們提供的這個初步研究資料希望對