胰腺十二指腸同源盒（PDX-1）在2型糖尿病大鼠胰腺組織中的表達(dá)及羅格列酮的干預(yù)作用.pdf

1、目的：2型糖尿病的病因極為復(fù)雜，目前尚未完全清楚，但其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是胰島素抵抗和胰島素的分泌缺陷，胰島素分泌缺陷在從NGT到IGT和IGT到糖尿病的過程，起了決定性的作用。長期高血糖、高血脂是胰島素分泌缺陷發(fā)生的始動因素，也是糖尿病的重要特征。糖脂毒性可以損傷在胰島素分泌中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子胰腺十二指腸同源盒(PDX-1)，使得胰島素分泌減少。機(jī)體發(fā)育成熟后，PDX-1作為轉(zhuǎn)錄因子在胰腺中特異性表達(dá)，可以促進(jìn)胰腺的早期發(fā)育和晚期胰島

2、細(xì)胞的分化，調(diào)節(jié)胰島素基因及胰島素分泌相關(guān)基因的表達(dá)，影響胰島素的合成分泌。PDX-1表達(dá)受損導(dǎo)致的胰島素分泌減少，進(jìn)一步加重了糖尿病的糖脂代謝紊亂。因此，研究糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中PDX-1的表達(dá)變化，尋找和發(fā)現(xiàn)調(diào)控PDX-1表達(dá)和功能的藥物，對闡明糖尿病發(fā)病機(jī)制、進(jìn)行有效的治療和減緩糖尿病的發(fā)展均具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察長期高脂飲食加小劑量STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病模型中胰島素變化和PDX-1的表達(dá)變化，探討PDX-1在糖

3、尿病發(fā)病中的作用；并通過應(yīng)用TZD類藥物羅格列酮(rosiglitazone)進(jìn)行干預(yù)，探討TZD改善胰島細(xì)胞功能的作用機(jī)制。 方法：健康Whistar雄性大鼠45只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，隨機(jī)分為普通飲食組(A組)15只，和高脂飲食組30只，給予高脂飲食喂養(yǎng)2月，按HOMA指數(shù)判斷出現(xiàn)胰島素抵抗后，腹腔注射STZ(streptozotocin，STZ )造模。將成模大鼠(共24只)隨機(jī)分為兩組(每組12只)： 2型糖尿病未干預(yù)組(B

4、組)，繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)；羅格列酮治療組(C組)高脂飼料加羅格列酮，繼續(xù)喂養(yǎng)2個月。所有大鼠實(shí)驗(yàn)期間自由飲水、進(jìn)食。分籠飼養(yǎng)，每籠4-5只。 每組大鼠均于實(shí)驗(yàn)開始、結(jié)束時稱量體重、取血。大鼠自試驗(yàn)前一日20:OO起禁食，試驗(yàn)日8:00分別自內(nèi)眥靜脈采血，分離血清，保存于-20℃，用于各指標(biāo)的檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時留取胰腺組織一部分液氮保存，用于測定InsulinmRNA和PDX．1RNA表達(dá)；一部分組織．80凍存，用于測定PDX-1蛋

5、白表達(dá)；其余部分以4％中性多聚甲醛固定，待組織學(xué)檢查。 1 血糖、胰島素的測定血糖用葡萄糖氧化酶法測定；胰島素用放射免疫法測定。采用穩(wěn)態(tài)模型(Homeoestasis Model Assessment，HOMA)及胰島素敏感指數(shù)(Insulin Sensitivity Index，ISI)評價胰島素抵抗的程度。 2 血脂的測定甘油三脂(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterole，T

6、C)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein-cholesterole，HDL-C)比色法測定，Cu<'2+>比色法測定游離脂肪酸(FFA)含量。 3 口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT)大鼠試驗(yàn)結(jié)束前行0GTT試驗(yàn)。步驟如下：大鼠自試驗(yàn)前一日20：00起禁食，試驗(yàn)日8：OO用葡萄糖灌胃2.0g/kg體重，于灌胃前(0min)、灌胃后30min、60min、120 min、180min分別自內(nèi)眥靜脈采血0.5

7、-1ml，測血糖、胰島素。即刻測血糖，余血標(biāo)本離心，血清貯存于-20℃冰箱待檢。 4 胰腺組織InsulinmRNA和PDX-1mRNA表達(dá)的測定用Trizol Kit提取胰腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別擴(kuò)增Insulin、PDX-+1和β-actin mRNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳、攝片和計算機(jī)圖像掃描。RT-PCR產(chǎn)物半定量：因β-actin在組織中均勻表達(dá)，Insulin、PDX-1基因的表達(dá)水平

8、用靶基因與β-actin的比值表示。 5 胰腺組織PDX-1蛋白表達(dá)的測定提取胰腺組織總蛋白并考馬氏亮藍(lán)G250法進(jìn)行蛋白定量，依照常規(guī)Wrestem Blot操作步驟進(jìn)行，凝膠成像系統(tǒng)對所獲條帶進(jìn)行分析。PDX-1蛋白的表達(dá)水平用PDX-1與β-actin的比值表示。 6 形態(tài)學(xué)檢查常規(guī)方法制備大鼠胰腺光鏡組織切片，行HE及Insulin、PDX-1免疫組化染色。 7 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS11.0

9、軟件處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?±S)表示，組間差異用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，兩組以上比較采用單因素方差分析作統(tǒng)計學(xué)處理。檢驗(yàn)的顯著性用P值表示。P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為差異有極顯著性。 結(jié)果： 1 對體重的影響實(shí)驗(yàn)初，大鼠隨機(jī)分組，各組體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差別，具有可比性。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M體重(398.67±26.83g)明顯高于正常對照組(370.93±16.60g)，有顯著性差異(P<0.01)。羅

10、格列酮干預(yù)組(388.87±17.86g)體重與正常對照組相比有顯著性差異(P<0.01)，與糖尿病模型組比較雖有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。 2 對血脂的影響STZ造模后模型組大鼠的(TC)、(TG)、及FFA均明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(P<0.01)；HDL降低，與正常組相比有顯著性差異(P<0.01)。羅格列酮干預(yù)組的(TC)、(TG)、及FFA比模型組明顯降低(P<0.01)，但仍高于正常組(P<0.05-0

11、.01)；HDL經(jīng)干預(yù)后模型組升高(P<0.05)，但仍低于正常對照組(P<0.01)。 3 OGTT結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，空腹血糖及葡萄糖灌胃后30、60、120、180min各時間點(diǎn)血糖糖尿病模型組均明顯高于NC組(P<0.01)。羅格列酮干預(yù)組各時間點(diǎn)血糖均明顯低于模型組(P<0.01)。胰島素抵抗指數(shù)模型組(2.96±0.34)明顯高于正常對照組(1.13±0.23)(P<0.01)，而胰島素敏感指數(shù)(-6.06±0.29)

12、明顯低于正常組(-4.38±0.22)(P<0.01)，經(jīng)羅格列酮治療后兩者均得到改善。 4 葡萄糖刺激的β細(xì)胞胰島素釋放功能正常對照組空腹胰島素水平(15.08±2.16mIU/L)，血漿胰島素于口服葡萄糖后60 min達(dá)峰值(84.83±1.73 mIU/L)，約為基礎(chǔ)值的5.6倍。糖尿病模型組空腹胰島素水平(29.14±5.11 mIU/L)較正常組顯著升高(P<0.01)，血漿胰島素于口服葡萄糖后120min達(dá)峰值(1

13、02.72±2.88 mIU/L)，明顯延遲且僅為基礎(chǔ)值的3.5倍。羅格列酮干預(yù)組空腹胰島素水平(18.04±2.30mIU/L)較模型組明顯降低(P<0.01)，血漿胰島素于口服葡萄糖后60 min達(dá)峰值(80.5±1.70mIU/L)。胰島素釋放曲線接近正常形態(tài)。 5 胰腺病理形態(tài)的改變HE染色光鏡下觀察，模型組大鼠胰腺與正常對照組比較無明顯改變。 6 免疫組化胰腺組織Insulin和PDX-1蛋白表達(dá)水平變化免疫

14、組化顯示陽性胰島β細(xì)胞胞漿呈棕黃色，模型組胰腺胰島中胰島素染色陽性區(qū)域面積百分比值(β/T area，％)(12.75±2.18)顯著低于正常對照組(42.61±2.68)，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，經(jīng)羅格列酮干預(yù)后(20.67±2.14)較糖尿病模型組顯著增加(P<0.01)，但仍低于正常對照組(P<0.01)，提示經(jīng)羅格列酮干預(yù)后胰島細(xì)胞數(shù)量明顯增加；光密度各組無顯著性差異，提示各組問B細(xì)胞內(nèi)胰島素含量無明顯差異。PDX-1在胰

15、島細(xì)胞胞漿和胞核中均有表達(dá)，糖尿病模型組(0.240±0.051)的表達(dá)水平較正常對照組(0.648±0.087)顯著降低，經(jīng)羅格列酮干預(yù)后(0.460±0.045)PDX-1表達(dá)較模型組顯著增高(P<0.01)，較正常組仍處于低水平(P<0.01)。 7 胰腺組織InsulinmRNA和PDX-1mRNA表達(dá)水平的變化在模型組大鼠胰腺組織Insulin mRNA(0.21±0.023)和PDX-1mRNA(0.153±0.0

16、71)的表達(dá)明顯低于正常對照組(0.527±0.025)和(0.49±0.032)(P<0.01)，羅格列酮干預(yù)組(0.351±0.035)和(0.370±0.029)與模型組比較明顯增高(P<0.01)。 8 Western B10t胰腺組織PDX-1蛋白表達(dá)水平變化模型組胰腺PDX-1蛋白表達(dá)水平(0.253±0.028)明顯低于正常對照組(0.720±0.036)(P<0.01)，給予羅格列酮治療后(0.59±0.050

17、)表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)，但仍低于正常對照組。 結(jié)論 1 長期高脂飼養(yǎng)并小劑量STZ腹腔注射可成功復(fù)制2型糖尿病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，表現(xiàn)在血糖、血脂增高，β細(xì)胞量減少，葡萄糖刺激的胰島素分泌第一時相明顯減弱，第二時相高峰延遲。 2 2型糖尿病大鼠血糖、血脂增高，β細(xì)胞量減少同時，InsulinmRNA和PDX-1mRNA及其相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平均下降，提示了PDX-1在糖尿病發(fā)病中的作用。 3 PPAR-γ激