2型糖尿病大鼠肺組織病變發(fā)生機(jī)制及羅格列酮干預(yù)的研究.pdf

1、早在20世紀(jì)70年代Schuyler等就首次提出肺臟可能是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的靶器官之一。隨著糖尿病并發(fā)癥研究的深入，糖尿病肺部損害已經(jīng)越來(lái)越受到關(guān)注。糖尿病時(shí)肺部呈非特異性功能變化，如肺彌散功能下降，易于發(fā)生肺纖維化，合并感染等。1型、2型糖尿病患者存在不同程度的限制性、阻塞性或混合性通氣障礙及彌散障礙，但發(fā)生機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)的研究表明核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B NF-

2、κ B)及其抑制蛋白(inhibitor κ B，I κB)信號(hào)通路在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 目的：本試驗(yàn)旨在通過(guò)檢測(cè)2型糖尿病大鼠肺組織中NF-κ B P65、I κ B Q、TGF-β1。、PKC的變化情況及相關(guān)性，探討糖尿病肺組織損傷與核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)及其抑制蛋白IκB信號(hào)通路的關(guān)系，提出NF-κB信號(hào)通路激活可能是糖尿病肺發(fā)病機(jī)制之一，同時(shí)觀察具有抗炎作用的噻唑烷二酮類(lèi)(thiazolidine

3、diones，TZDs)降糖藥物羅格列酮的干預(yù)作用，從而為治療糖尿病肺提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：通過(guò)高糖、高脂飲食加腹腔注射小劑量鏈尿佐菌素(streptozotocin，STZ)的方法，建立2型糖尿病大鼠模型，采用光鏡動(dòng)態(tài)觀察12w、24w時(shí)，對(duì)照組、糖尿病組、羅格列酮治療組的大鼠肺組織的形態(tài)學(xué)改變情況，用Masson三色染色觀察肺組織膠原沉積情況，應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)方法檢測(cè)各組肺組織NF

4、-κBP65、IκBα、TGF-β1、PKC的變化情況。 結(jié)果： 1.癥狀、體征糖尿病組大鼠在注射STZ后一周內(nèi)出現(xiàn)多尿、多飲、多食癥狀，12w時(shí)癥狀已明顯。隨病程的延長(zhǎng)，上述癥狀更加顯著，并出現(xiàn)毛發(fā)干燥，色澤黯淡，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少。整個(gè)病程中體重稍有下降，與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。羅格列酮治療組大鼠的上述癥狀無(wú)明顯改善. 2.生化指標(biāo)的改變：12w時(shí)，DM組大鼠空腹血糖、胰島素、甘油三酯較對(duì)照組明顯增加(P＜

5、0.05)。隨著病程延長(zhǎng)至24w時(shí)DM組大鼠的甘油三酯水平較12w時(shí)增高更加明顯，同時(shí)膽固醇水平也明顯升高，與對(duì)照組和12w DM大鼠相比均有顯著性差異(P＜0.01)；而空腹血糖和胰島素一直維持在較高水平，12w與24w的變化不明顯。羅格列酮治療組大鼠空腹血糖、甘油三酯較同期DM組有下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，胰島素和膽固醇明顯下降，與DM大鼠組相比較，胰島素水平具有顯著差異(p＜0.05)。 3.HE染色結(jié)果：光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組大鼠肺

6、泡分布均勻，結(jié)構(gòu)完整，由單層肺泡上皮和基膜組成，相鄰肺泡之間有少量結(jié)締組織。12w DM大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管壁、肺泡壁增厚，肺泡上皮細(xì)胞顯示不清，肺泡萎縮、塌陷，肺間質(zhì)和血管周?chē)?xì)胞外基質(zhì)增多，成纖維細(xì)胞增多，并有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。24w DM大鼠的上述病理改變更加明顯。羅格列酮治療組肺組織病變較對(duì)照DM組明顯減輕，但肺組織結(jié)構(gòu)未恢復(fù)到正常。 4.Masson染色結(jié)果：對(duì)照組大鼠肺間質(zhì)之間、血管周?chē)猩倭磕z原纖維。12w時(shí)DM

7、大鼠肺間質(zhì)膠原纖維增多，排列紊亂，毛細(xì)血管周?chē)z原物質(zhì)增多，膠原面密度為0.08±0.02，高于同期對(duì)照組大鼠肺組織膠原面密度(0.05±0.06)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著糖尿病病程延長(zhǎng)，上述改變加重，至24w時(shí)肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡萎縮，甚至被膠原纖維取代。24w時(shí)DM大鼠肺臟膠原面密度為0.27±0.03，明顯高于對(duì)照組大鼠(0.08±0.03，P＜0.01)；與12w比較，24w時(shí)DM大鼠肺臟膠原面密度亦明顯增高(P＜0.01)。羅格

8、列酮治療組肺組織膠原積聚減輕，結(jié)構(gòu)趨于正常。羅格列酮組肺臟膠原面密度為0.16±0.01，兩兩比較結(jié)果顯示，對(duì)照組與24w DM組， 24w DM組與羅格列酮組之間均有顯著差異(p＜0.01)，而對(duì)照組與羅格列酮組有差異(p＜0.05)。 5.免疫組織化學(xué)檢測(cè) 5.1 NF-κB P65在肺組織中的表達(dá) 12w DM大鼠陽(yáng)性表達(dá)稍增加，染色淺，陽(yáng)性染色光密度值為0.20±0.01，大于同期對(duì)照組0.12±0.02，有差異

9、(p＜0.01)；24w DM大鼠陽(yáng)性染色光密度值為(0.35±0.06)，表達(dá)明顯增多，胞漿、胞核的棕黃色顆粒顏色較深，可見(jiàn)團(tuán)塊狀分布，多于12wDM大鼠(0.20±0.01)，有顯著性差異(p＜0.01)；亦明顯高于同期對(duì)照組(0.17±0.03，p＜0.01)；羅格列酮治療組大于對(duì)照組，少于24wDM大鼠組，陽(yáng)性染色光密度值為0.25±0.05，兩兩比較結(jié)果顯示，對(duì)照組與24w DM組，對(duì)照組與羅格列酮組，24w DM組與羅格列酮

10、組之間均有明顯差異(p＜0.01)。 5.2 I κ B α在肺組織中的表達(dá) 12w DM大鼠陽(yáng)性表達(dá)稍增加，染色淺，陽(yáng)性染色光密度值為0.29±0.002大于同期對(duì)照組(0.18±0.02，p＜0.01)；24w DM大鼠陽(yáng)性染色光密度值為(0.36±0.03)，表達(dá)明顯增多，胞漿、胞核的棕黃色顆粒顏色較深，可見(jiàn)團(tuán)塊狀分布，大于12w DM大鼠(0.20±0.01)，有顯著性差異(p＜0.01)；亦明顯高于同期對(duì)照組(0.22

11、±0.01，p＜0.05)；羅格列酮治療組大于對(duì)照組，少于24w DM大鼠組，陽(yáng)性染色光密度值為0.26±0.02，兩兩比較結(jié)果顯示，對(duì)照組與24w DM組，對(duì)照組與羅格列酮組，24w DM組與羅格列酮組之間均有明顯差異(p＜0.05)。 5.3 TGF-β1在肺組織中的表達(dá) 12w DM大鼠陽(yáng)性表達(dá)稍增加，染色淺，陽(yáng)性染色光密度值為0.22±0.02，大于同期對(duì)照組0.14±0.01，有差異(p＜0.01)；24w DM大鼠陽(yáng)

12、性染色光密度值為0.33±0.02，表達(dá)明顯增多，核表達(dá)增多，著色較深，呈團(tuán)塊狀分布，大于12w DM大鼠(0.22±0.02)，有顯著性差異(p＜0.01)；亦明顯高于同期對(duì)照組(0.16±0.00，p＜0.01)；羅格列酮治療組大于同期對(duì)照組，少于24w DM大鼠組，陽(yáng)性染色光密度值為0.23±0.02，兩兩比較結(jié)果顯示，對(duì)照組與24w DM組，對(duì)照組與羅格列酮組，24w DM組與羅格列酮組之間均有明顯差異(p＜0.01)。

13、 5.4 PKC在肺組織中的表達(dá)正常組大鼠肺泡上皮、支氣管上皮胞膜及胞漿有弱的陽(yáng)性表達(dá)。DM大鼠表達(dá)明顯增加，染色加深，肺泡上皮表達(dá)量增多，且胞膜表達(dá)多于胞漿表達(dá)。12w DM大鼠陽(yáng)性染色光密度值為0.25±0.05，明顯高于同期對(duì)照組大鼠(0.15±0.03，P＜0.05)。24w DM大鼠陽(yáng)性染色光密度值為0.32±0.03，明顯高于同期對(duì)照組大鼠(0.18±0.01，P＜0.05)，亦明顯高于12w組(0.25±0.05，p＜0.

14、01)；羅格列酮組大于同期對(duì)照組，少于24w DM大鼠組，陽(yáng)性染色光密度值為0.21±0.03，兩兩比較結(jié)果顯示，對(duì)照組與24w DM組、對(duì)照組與羅格列酮組、24w DM組與羅格列酮組之間均有差異(p＜0.01)。 6.NF-κB P65與IκBα的相關(guān)性分析NF-κB P65蛋白的表達(dá)與IκBα蛋白的表達(dá)之間成正相關(guān)(r=0.8401，p＜0.0001)。 7.NF-κB P65與TGF-β1的相關(guān)性分析NF-κB P

15、65蛋白的表達(dá)與TGF-β1蛋白的表達(dá)之間成正相關(guān)(r=0.8795，p＜0.0004)。 8.NF-κB P65與PKC的相關(guān)性分析NF-κB P65蛋白的表達(dá)與PKC蛋白的表達(dá)之間成正相關(guān)(r=0.7939，p＜0.0000)。 結(jié)論： 1. 高糖高脂飲食加小劑量STZ腹腔注射成功制備2型DM大鼠模型2型糖尿病大鼠肺組織出現(xiàn)病理改變和膠原纖維成分的沉積，表明肺臟是糖尿病的又一靶器官。 2. 2型糖尿病

16、大鼠肺組織NF-κB P65、IκB α、TGF-β1表達(dá)增多，PKC活性增強(qiáng)。隨病情進(jìn)展，表達(dá)愈加明顯，表明糖尿病高糖狀態(tài)下，PKC活性增強(qiáng)，激活NF-κB，其抑制蛋白Iκ Bα降解增多，發(fā)生核轉(zhuǎn)錄，表達(dá)增多，使TGF-β1激活，表達(dá)增多。同時(shí)NF-κB P65與IκB α、TGF-β1。PKC之間有正相關(guān)性，提示NF-κB/IκB信號(hào)通路參與糖尿病肺組織病變的發(fā)生發(fā)展，可能是肺損傷的機(jī)制之一。 3. 羅格列酮治療組大鼠肺組織