Mcm3及骨轉(zhuǎn)換相關基因表達與氟中毒關系的研究.pdf

1、目的：氟與人體生命活動及牙齒、骨骼組織代謝密切相關。一方面，氟是預防齲齒有益的微量元素之一，另一方面，人體長期暴露在高氟環(huán)境下，從外界環(huán)境獲得氟超過生理需要，可導致全身慢性中毒，成為地方性氟中毒。課題組前期研究采用基因芯片的方法對氟骨癥患者外周血淋巴細胞基因差異表達進行了篩選發(fā)現(xiàn)對照組與氟骨癥組比較后從中選出ras，TM9SF1，COL9A3，Mcm3四個基因予以研究。隨后發(fā)現(xiàn)Mcm3基因在小鼠成骨細胞染氟后，表達上調(diào)可達2.5倍，顯示

2、出可能具有氟中毒早期生物標志意義。
　　 首先在人群中用熒光定量PCR技術驗證Mcm3在暴露和非暴露組間的差異，與此同時測定和分析兩組的肝腎功能和transmembrane 9 superfamily member 1（TM9SF1）的表達。然后對Mcm3基因（minichromosome maintenance deficient 3）在氟中毒體外模型中的表達特征予以證實，同時觀察在不同劑量氟作用下體外培養(yǎng)成骨細胞中Mcm3基

3、因在增殖成骨細胞中的表達情況，以及對細胞增殖，氧化應激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，骨轉(zhuǎn)化（堿性磷酸酶、骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋蛋白、Runx2、 Osterix、collagen I）情況，以求較完整的反應氟中毒情況下Mcm3表達的變化和細胞內(nèi)其它分子反應的概況，并在此基礎上探討氟骨癥發(fā)病可能的關鍵環(huán)節(jié)與調(diào)控機制，更進一步揭示氟中毒所致氟骨癥的分子發(fā)病機制，為氟骨癥的早期診斷及治療提供科學依據(jù)。
　　 方法：
　　 （1）選取飲水型氟中

4、毒輕度暴露者、對照各11例，采用SYBRGreen1嵌合熒光法進行實時定量PCR的方法，檢測氟中毒暴露者和對照組外周血淋巴細胞中Mcm3和TM9SF1 mRNA的表達。生物化學方法測定兩組血清的反映肝、腎功能狀態(tài)的指標。
　　 （2）體外培養(yǎng)人成骨細胞Saos-2，空白培養(yǎng)基為對照組，實驗2.5、5、10、20、40、80mg/L NaF組為試驗組，在24 h后以MTT法和Alamar Blue法測定氟作用下細胞的增殖以及酶學方

5、法測定氧化損傷（SOD，MDA）情況。提取成骨細胞RNA，采用熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（real-time RT-PCR）方法檢測Runx2和Osterix mRNA及下游基因COL1A2的表達。用化學比色法測定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。實時定量PCR（Real-time PCR）測定成骨相關基因：骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨鈣素（osteocalcin，OC）、

6、骨橋蛋白（osteopontin，OP）和Mcm3（minichromosone maintenance 3，Mcm3）的表達。以雙標準曲線法計算基因表達的相對比值。
　　 （3）原代培養(yǎng)成骨細胞，并設立空白組和衣霉素陽性對照組。24h后western blot檢測成骨細胞內(nèi)BIP、XBP-1、CHOP、PDI、Mcm3表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 （1）暴露組、對照組人群Mcm3和TM9SF1 mRNA 表達

7、均略高于對照人群，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。所測的肝腎功能指標在兩組中差異未顯示出統(tǒng)計學意義。
　　 （2）與對照組相比，氟化鈉濃度小于20mg/L時，對細胞均呈現(xiàn)出增殖作用。其中以10 mg/L（此時F-濃度約為4.52ppm）組的促增殖作用最強。當氟化鈉濃度大于20mg/L時，對細胞以抑制作用為主。兩種方法的結(jié)果相似。在受試時間內(nèi)80 mg/L組成骨細胞SOD活性較對照組顯著下降（P＜0.05）?？傮w上看，SOD活

8、性在氟作用受試濃度下，變化的波動性不大。而2.5-80mg／L組MDA含量明顯增加，從20mg/L組起差異有統(tǒng)計學意義；總體上看，從2.5mg／L NaF組起的成骨細胞MDA水平逐漸提高。
　　 （3）成骨細胞在體外染氟培養(yǎng)24h后，Osterix的表達，與對照組相比較，呈現(xiàn)出低劑量促進表達，高劑量抑制表達的雙向反應形式：在2.5mg/L時表達量呈上升水平，而后隨NaF劑量增加，表達下降明顯。當NaF劑量為2.5-5mg/L時成

9、骨細胞內(nèi)基因Runx2表達水平均有不同程度增加，隨后逐漸下降，至5mg/L時為最低。Ⅰ型膠原表達方式呈現(xiàn)出雙向反應：劑量為2.5mg/L時，表達上調(diào)；劑量為5～80mg/L時，表達下調(diào)。
　　 （4）隨著氟化鈉濃度的增高，ALP的活性增加。在NaF劑量為2.5～5.0mg/L時Mcm3表達與對照組相比是下降的，在10mg/L時表達為對照組的21.3倍，但在20、40 mg/L時表達量又低于對照組；OC的表達從2.5 mg/L時開

10、始隨劑量上升而下調(diào)；BSP的表達試驗組2.5～10 mg/L 時BSp較對照組表達明顯上調(diào)，當作用劑量為20～40mg/L時BSP表達明顯下降，僅略高于對照組；OP表達量在7個實驗組中均高于對照組，基本上呈現(xiàn)出隨劑量升高表達量下降，至40mg /L時表達量最低。
　　 （5）各干預組PDI蛋白表達量與空白對照與比較差異未見統(tǒng)計學意義（P＞0.05），XBP-1在10mg/L氟化鈉組起表達明顯高于空白對照，并隨氟劑量表達量增加。從

11、2.5mg/L氟化鈉組起骨細胞中的BIP/β-actin高于對照組（P＜0.05）；從10mg/L氟化鈉起，各加氟組的CHOP／GAPDH比對照組高（P＜0.05）。Mcm3蛋白表達能夠被衣霉素所下調(diào)，而在其它濃度的氟作用下均有不同程度的表達上調(diào)，但無明顯劑量反應關系。
　　 結(jié)論：
　　 （1）氟暴露可以使患者外周血中Mcm3和TM9SF1 mRNA表達輕度上調(diào)，兩種指標在兩組調(diào)查人群中的差異無統(tǒng)計學意義。氟對暴露者肝

12、、腎功能的影響需要選取更多的指標綜合分析，需要進一步評價。
　　 （2）NaF具有低劑量促進細胞增殖，高劑量抑制細胞增殖的雙相作用。氟對成骨細胞可以造成氧化損傷。
　　 （3）Mcm3表達不規(guī)律并不適合作為診斷及監(jiān)測成骨細胞在過量氟作用下的生物標志。氟化鈉可能通過影響各成骨相關基因的表達而促進成骨分化。
　　 （4）氟可影響成骨細胞Runx2和Osterix mRNA表達，表達水平與染氟的劑量有關。Runx2和O